獼猴桃AFLP分析體系的建立及其組培變異苗的動態檢測

呂天雯，栗望薇，張太奎，劉惠民，李　琨

(1.西南林業大學 生命科學學院，云南 昆明 650224； 2.昆明理工大學 信息工程與自動化學院，云南 昆明 650504)

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獼猴桃AFLP分析體系的建立及其組培變異苗的動態檢測

呂天雯1，栗望薇1，張太奎1，劉惠民1，李琨2，*

(1.西南林業大學 生命科學學院，云南 昆明 650224； 2.昆明理工大學 信息工程與自動化學院，云南 昆明 650504)

為減少獼猴桃組培過程中變異苗帶來的損失，對‘Hort 16A’獼猴桃組培繼代苗進行AFLP動態監測。通過試驗建立了獼猴桃基因組DNA多態性的AFLP分析體系，并對R7-R11五代75個樣本進行遺傳多樣性分析。研究結果表明：AFLP分析體系DNA最適用量為300 ng，內切酶最適用量為1 U，酶切最適時間為4 h，T4-DNA ligase最適用量為1 U，adpter最適用量為1.5 μL，ATP最適用量為2 μL，預擴增引物(100 μmol·L-1)最適用量為0.8 μL，選擇性擴增Taq酶最適用量為0.25 μL (5 000 U·mL-1)，篩選出條帶數最多的引物有8對。在遺傳多樣性分性中，共得到494個條帶，其中多態性條帶為310條，多態性比例為62.7%。獼猴桃組培苗繼代到第9代還能較好地保持基因遺傳穩定性，從第10代開始，變異率隨著繼代次數的增加呈明顯上升趨勢。

獼猴桃；AFLP分析體系；組培變異；繼代苗；動態檢測

中華獼猴桃(ActinidiachinenesisPlanch)在分類上是屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)的多年生藤本植物，是一種原產于中國的重要果樹資源[1-2]。由于獼猴桃具有較高的營養價值、藥用價值和經濟價值，所以對它的研究備受關注。其栽種方式有扦插、嫁接、播種和組培[3-6]，目前多以組培的方法來擴繁優良品種。在組培中，由于離體條件本身、植物生長調節物質、培養基滲透壓、培養溫度及培養時間、培養基的組成、激素的組成、含量和外植體再生方式等原因誘使組培苗發生變異。組培苗的變異一直都是植物組培過程中的難點，變異會影響植株的優良性狀，產生不利的影響。吳偉懷等[7]在對香蕉進行組織培養時發現香蕉組培苗發生了變異；杜國強等[8]也發現蘋果莖尖組培苗在繼代過程中會發生變異；劉昀等[9]在香花槐組培苗快繁體系研究中發現培養基不同會影響組培苗的變異；馬丹等[10]發現繼代次數對組培苗的變異會產生影響，變異產生概率可隨繼代次數的增加而增大，變異苗數量將成幾何級數增長。有些遺傳變異(如隱匿變異體)在組培過程中不易發現，到大田后期才能發現，經濟損失巨大。因此，在組培過程中對組培苗的變異情況進行監測顯得尤為重要。

常規的變異性狀鑒定方法，如形態觀察、細胞遺傳學分析等有其局限性，如果利用分子標記如RAPD對這些性狀進行選擇和監測，不僅能夠在早期選擇，而且不需創造逆境條件，可以節省大量的人力、物力和時間，提高育種效率[11]。常用的監測方法有RFLP，SSR，ISSR，SNP，PAPD和AFLP等，其中AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性)的分子標記技術具有檢測位點多、多態水平高、分子識別率好、結果穩定可靠等特點[12-17]。為此，我們采用AFLP技術動態監測獼猴桃組培苗的變異情況，通過對獼猴桃基因組DNA多態性分析、AFLP體系的優化、酶切體系和連接體系的確定、預擴增體系和選擇性擴增體系的反復試驗、引物的篩選，對繼代苗進行多態性統計分析，監測獼猴桃組培繼代苗的變異率。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

以‘Hort 16A’獼猴桃組培繼代苗R7，R8，R9，R10和R11(最早的樣本為R0，繼代1次為R1)為材料。從繼代苗中每代隨機選出15株小苗，每株小苗采摘1～2片新鮮葉片，分別裝于自封袋中，做好標記后放于-80 ℃保存。所用試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2試驗方法

基因組DNA的提取：采用CTAB法從獼猴桃葉片提取基因組DNA。

酶切：進行一個L16(45)正交試驗。將配好的體系放入PCR儀中，37 ℃ 4 h，65 ℃水浴20 min。結束后取2 μL進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測電壓5 V·cm-1，電泳20 min。

連接：進行一個L9(34)正交試驗。將配好的體系(20 μL)放入PCR儀中，25 ℃ 2 h，65 ℃ 30 min，4 ℃ 1 h。PCR完成后取2 μL進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓5 V·cm-1，電泳20 min。

預擴增時對引物用量進行篩選。根據單因素隨機區組對引物(100 μmol·L-1)用量設計了0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μL 5個梯度進行試驗。配好體系(25 μL)后將PCR管放入PCR儀中，進行預擴增。PCR結束后取2 μL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓5 V·cm-1，電泳20 min。

選擇性擴增要對Taq酶用量和引物的配對進行篩選。根據單因素隨機區組對Taq酶(5 000 U·mL-1)用量設計了0.125，0.150，0.200，0.250 μL等4個濃度梯度進行試驗。采用64對引物的排列組合進行引物的配對篩選。配好體系(25 μL)后將PCR管放入PCR儀中進行選擇性擴增，在選擇性擴增PCR時，退火溫度每循環遞減0.7 ℃。PCR結束后取2 μL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測電壓5 V·cm-1，電泳20 min。

參照張太奎[18]的方法進行PAGE變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。選擇性擴增產物在6%的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。30 min預電泳后，600 V恒壓，25 mA電泳4.5 h。銀染顯色，膠板干燥后拍照。

2　結果與分析

2.1基因組DNA的提取

由圖1可看出：用CTAB法和CTAB區室法都成功提取出了獼猴桃DNA。DNA的濃度越高、雜質越少則說明其純度越高。條帶1—8與條帶9—15相比亮度更亮，且雜質含量比較少，表明用CTAB區室法提取的DNA純度較CTAB法高。

2.2酶切

由圖2-A可知：第4，5，6，10，11和15號條帶呈現彌散的片段，且彌散片斷在500 bp左右，說明酶切效果較好。第1，2和14號條帶彌散效果不明顯，說明酶切效果不理想。由圖2-B可知：隨著DNA用量的增加，酶切效果呈現先優后劣的趨勢；隨著內切酶用量的增加，酶切效果呈現一直下降的趨勢；隨著酶切時間的增加，酶切效果呈現先優后劣再優的趨勢。綜上可知，DNA最適用量為300 ng，內切酶最適用量為1 U，酶切最佳時間為4 h。

條帶1—8為CTAB區室法提取的獼猴桃基因組DNA；條帶9—15為CTAB法提取的獼猴桃基因組DNA。圖1　獼猴桃基因組DNA電泳圖Fig.1　Electropherogram of genomic DNA of Actinidia chinenesis

2.3連接

由圖3-A可知：第1，2，3，5和8號條帶亮度較亮，拖帶清晰，且片段大小在500 bp左右，說明連接效果較好。第4，6，7，9和10號條帶亮度較暗，看不清有拖帶，說明連接效果不理想。由圖3-B可知，隨著T4-DNA ligase用量的增加，連接效果呈現一直下降的趨勢；隨著adpter用量的增加，連接效果呈現一直上升的趨勢；隨著ATP用量的增加，連接效果呈現一直上升的趨勢。由于圖中沒有一個表現最高值的轉折點，所以，該試驗是在一個區間中找最適值。所以在1～3 U區間中T4-DNA ligase最適用量為1 U；在0.5～1.5 μL區間中adpter最適用量為1.5 μL；在0～2 μL區間中ATP最適用量為2 μL。

圖2　酶切產物電泳圖(A)及酶切效果綜合評價(B)Fig.2　Electropherogram of enzyme digestion (A) and comprehensive evaluation of enzyme digestion (B)

圖3　連接產物電泳圖(A)及連接效果綜合評價(B)Fig.3　Electropherogram of ligation (A) and comprehensive evaluation of ligation (B)

2.4預擴增

由圖4-A可知：預擴增的5個條帶亮度都很明亮，拖帶的分散也比較均勻，且片段大小在500 bp左右，說明預擴增效果比較好。由圖4-B可知，隨著預擴增引物用量的增加，預擴增效果呈現先劣后優再劣的趨勢。綜上可知，預擴增引物(100 μmol·L-1)最適用量為0.8 μL。

2.5選擇性擴增

由圖5-A可知：第13—18，33—41，44—50號條帶在500 bp的位置呈現均勻的彌散，說明選擇性擴增效果比較好。由圖5-B可知：隨著Taq酶用量的增加，選擇性擴增效果呈現一直上升的趨勢。綜上可知，選擇性擴增的最適Taq酶(5 000 U·mL-1)用量為0.25 μL。

2.6引物篩選

由圖6可知：第9，14，30，41，43，45，59和60號譜帶在500～700 bp條帶數目較多且條帶清晰，說明選擇性擴增效果比較好。其他譜帶有的條帶很少，有的條帶在800～1 000 bp，因此不做選擇。根據電泳圖選擇的最好的譜帶與引物對對比，從64對引物中篩選出E-AGG+M-CAT，E-ACT+M-CAG，E-AGG+M-CAG，E-ACG+M-CTG，E-AAG+M-CTG，E-ACG+M-CAA，E-AAG+M-CAA和E-ACG+M-CAG 8對條帶數最多、條帶最亮的引物組合。

2.7PAGE變性聚丙烯酰銨凝膠電泳

在PAGE變性聚丙烯酰銨凝膠電泳中，確定了PA膠的配比，即APS的最適用量為160 μL，TEMED最適用量為60 μL，所制膠板至少聚合4 h后再使用；在銀染過程中確定了銀染的最適時間為30 min，銀染液的最適質量濃度為2 g·L-1；在顯影過程中確定了顯影液無水碳酸鈉的最適用量為60 g·L-1，顯影8 min左右條帶最清晰。

圖4　預擴增產物電泳圖(A)和預擴增效果綜合評價(B)Fig.4　Electropherogram of pre-amplification (A) and comprehensive evaluation of pre-amplification (B)

圖5　選擇性擴增產物電泳圖(A)選擇性擴增綜合評價(B)Fig.5　Electropherogram of selective amplification (A) and comprehensive evaluation of selective amplification (B)

圖6　引物篩選電泳圖Fig.6　Electropherogram of primer selection

2.8組培苗的AFLP動態監測

對PAGE變性聚丙烯酰銨凝膠電泳后顯影出的條帶進行統計，并對篩選的8對引物對進行擴增反應，共得到494個條帶，其中多態性條帶為310條，多態性比例為62.7%。另外，在統計中發現R7，R8和R9 3代的變異系數很小，基本沒有特異的條帶，每對引物所對應的條帶都很整齊。R10代有少量的特異性條帶，R11代總條帶數量較多，特異性條帶的數量也較多，說明R11代的變異系數較大。繼代次數與變異率關系如圖7所示，R7，R8和R9代比較穩定，幾乎沒有發生變異，從R10代開始變異率隨著繼代次數的增加呈上升趨勢。綜上可知，獼猴桃組培苗繼代到第9代還能較好地保持其遺傳穩定性，從第10代開始發生了較多變異。

圖7　繼代次數與變異率的關系Fig.7　The relationship between subculture and variation rate

3　結論與討論

本研究優化了獼猴桃多態性評價的AFLP體系，優化后的體系為：300 ng基因組DNA用內切酶酶切4 h，加入1 U T4-DNA ligase，1.5 μL adpter和2 μL ATP進行連接，預擴增引物(100 μmol·L-1)用量為0.8 μL，選擇性擴增Taq酶(5 000 U·mL-1)用量為0.25 μL。

本研究從64對引物中篩選出E-AGG+M-CAT，E-ACT+M-CAG，E-AGG+M-CAG，E-ACG+M-CTG，E-AAG+M-CTG，E-ACG+M-CAA，E-AAG+M-CAA和E-ACG+M-CAG共8對擴增條帶數最多、條帶最亮的引物組合。這8對引物對能夠對獼猴桃組培繼代苗的多態性進行評價。所篩選的引物對與秦小波等[19]在西南特色獼猴桃的遺傳多樣性中所選的引物對有所差異，秦小波等是在256對選擇性擴增引物對中篩選，而且所檢測的樣本也與本試驗不同，因此，所選引物對會存在差異。

獼猴桃組培苗在繼代增殖分化階段會發生變異，變異植株的分子檢測成了生產中急需解決的問題。同時工廠化大規模生產時無法對所有組培苗進行檢測，因此確定獼猴桃能較好地保持其遺傳穩定性的繼代代數對大規模生產有重要意義。目前，國內外對品種的遺傳變異監測主要通過植物形態學進行鑒定和分析，但是植株的很多基因水平的變異不全部表現在性狀上，只有少數能夠通過形態學分析鑒定出來，僅僅依靠形態學的觀察往往很難做出準確的檢測。本試驗對獼猴桃繼代7～11次的組培苗進行了動態監測，結果表明，獼猴桃組培苗繼代到第9代還能較好保持其基因的遺傳穩定性，但從第10代開始，隨著繼代次數的增加，變異率開始增大。

[1]FERGUSON A R. The genusActinidia[M] // WARRINGTON I J, WESTON G C. Kiwifruit: science and management. Auckland: Ray Richard Publ and New Zealand Soc Hort Sci, 1990: 15-35.

[2]HUANG H， WANG Y， ZHANG Z， et al.Actinidiagermplasmresources and kiwifruit industry in China [J].HortScience， 2004， 39(6): 1165-1172.

[3]龔弘娟， 李潔維， 蔣橋生， 等. 不同植物生長調節劑對中華獼猴桃扦插生根的影響[J]. 廣西植物， 2008， 28(3): 359-362.

[4]王天升， 方松烈， 郇延武， 等. 獼猴桃嫁接育苗[J]. 園林， 2000 (7)：37-38.

[5]李桂君， 宋嘉隆， 王令軍， 等. 葛棗獼猴桃播種育苗技術[J]. 中國林副特產， 2010 (4): 55-55.

[6]陽小成， 王伯初， 葉志義， 等. 中華獼猴桃的組織培養及其實用快速繁殖[J]. 重慶大學學報(自然科學版)， 2002， 25(6): 75-77.

[7]吳偉懷， 鄭肖蘭， 鄭服叢. 香蕉組培苗變異的原因、防止及其利用研究綜述[J]. 中國南方果樹， 2007， 36(4): 31-34.

[8]杜國強， 師校欣， 張慶良， 等. 蘋果不同繼代次數的莖尖組培苗同工酶酶譜及RAPD分析[J]. 園藝學報， 2006， 33(1): 33-37.

[9]劉昀， 李鳳霞， 鄭易之， 等. 香花槐組培苗快繁體系的建立及工廠化育苗的主要影響因素[J]. 應用與環境生物學報， 2004， 10(2): 162-165.

[10]馬丹， 侯彥龍. 馬鈴薯的繼代培養問題研究[J]. 農業技術與裝備， 2013 (14): 6-7.

[11]李莉， 官春云， 劉忠松. 植物體細胞無性系變異及其突變體的RAPD鑒定分析[J]. 作物研究， 2004， 18(5): 376-379.

[12]劉仁虎， 孟金陵. RFLP 和 AFLP 分析白菜型油菜和甘藍型油菜遺傳多樣性及其在油菜改良中的應用價值[J]. 遺傳學報， 2006， 33(9): 814-823.

[13]李麗， 王海崗， 張曉麗， 等. SSR 分子標記在作物遺傳育種中的應用[J]. 山西農業科學， 2008， 36(3): 15-18.

[14]朱巖芳， 祝水金， 李永平， 等. ISSR 分子標記技術在植物種質資源研究中的應用[J]. 種子， 2010 (2): 55-59.

[15]翟蕓， 周鋼橋， 董曉佳， 等. 大規模發掘及分型 SNP 技術平臺的建立[J]. 軍事醫學科學院院刊， 2004， 28(1): 52-56.

[16]陳啟亮， 李清國， 田瑞， 等. AFLP標記及其在園藝植物遺傳育種中的應用[J]. 長江大學學報(自然科學版)， 2005， 2(2): 19-24.

[17]林煒， 刁麗娟. RAPD 技術及其在動物遺傳多樣性分析中的應用[J]. 生物學通報， 2002， 37(3): 17-19.

[18]張太奎. 黃肉獼猴桃組培體系的建立及組培苗變異的AFLP動態監測[D]. 昆明: 西南林業大學， 2015.

[19]秦小波， 高繼海. 利用AFLP分析西南特色獼猴桃的遺傳多樣性[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2013， 21(4): 315-322.

(責任編輯侯春曉)

Construction of kiwifruit AFLP analysis system and dynamic monitoring of tissue culture variation of subculture seedling

LYU Tian-wen1， LI Wang-wei1， ZHANG Tai-kui1， LIU Hui-min1， LI Kun2,*

(1.CollegeofLifeSciences，SouthwestForestryUniversity，Kunming650224，China; 2.FacultyofInformationEngineeringandAutomation，KunmingUniversityofScienceandTechnology，Kunming650504，China)

In order to decrease the loss of variant seedlings in tissue culture， the variant rate of sub cultured seedlings of ‘Hort 16A’ was dynamically monitored by AFLPs in the study. The AFLP analysis system was set up and optimized， and the genetic diversity of 75 samples of R7-R11’s generations was studied too. The experiments showed that using 1 U restriction enzyme to digest 300 ng genomic DNA at 37 ℃ for 4 h in dual enzymes restriction could achieve the best effect. 1U T4 DNA ligase， 1.5 μL adpter and 2 μL ATP could get the best adpter ligation. The best dosage of pre-amplification primer was 0.8 μL (100 μmol·L-1) and that of the selective amplification ofTaqpolymerase was 0.25 (83 350 nkat·mL-1) μL. 8 pairs of primer whose number of amplified bands were the richest were selected. A total of 494 bands were amplified using these 8 pairs of primer， out of which 310 were polymorphic bands， and the polymorphic rate was 62.7%. The results showed that kiwi’s tissue subculture seedlings could maintain their genetic stability until the ninth generations. But from the tenth generation， the variant rate of sub cultured seedlings had an upward tendency.

kiwifruit(ActinidiachinenesisPlanch); AFLP analysis system; tissue culture variation ; subculture seedling; dynamic monitoring

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.12

2015-08-19

國家林業局948項目(2012-4-62)；國家星火計劃項目(2013GA105005)；云南省教育廳科學研究基金項目(2014Y316)

呂天雯(1975—)，女，云南永善人，碩士，講師，研究方向為生物技術。E-mail: 2442197585@qq.com

，李琨，E-mail: 1196972022@qq.com

S663.4

A

1004-1524(2016)04-0618-06

呂天雯， 栗望薇， 張太奎， 等. 獼猴桃AFLP分析體系的建立及其組培變異苗的動態檢測[J]. 浙江農業學報， 2016， 28(4): 618-623.