草麻黃高通量轉(zhuǎn)錄組分析及黃酮類代謝途徑相關(guān)基因的鑒定

馬　婧，成鐵龍，2，*，孫燦岳，鄧　楠，史勝青，江澤平

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所/國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091； 2.南京林業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境學(xué)院， 江蘇 南京 210037； 3.南寧樹木園，廣西 南寧 530031)

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草麻黃高通量轉(zhuǎn)錄組分析及黃酮類代謝途徑相關(guān)基因的鑒定

馬婧1，成鐵龍1，2，*，孫燦岳3，鄧楠1，史勝青1，江澤平1

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所/國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091； 2.南京林業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境學(xué)院， 江蘇 南京 210037； 3.南寧樹木園，廣西 南寧 530031)

草麻黃(EphedrasinicaStapf)植物富含黃酮類和生物堿類化合物，具有重要藥用價值，并且適應(yīng)性強(qiáng)，在防風(fēng)固沙、改善沙漠環(huán)境等方面具有重要作用。通過對已測序草麻黃轉(zhuǎn)錄組的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行重新組裝、拼接等生物信息學(xué)分析，共得到7 947 954個clean reads，13 389條unigene序列。經(jīng)過Nr，KOGs，GO，KEGG和Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫分析后，獲得10 481個Nr注釋，4 533個KOG功能注釋，7 121個GO功能注釋，5 833個KEGG注釋，8 039個 Swiss-Prot注釋，并利用KEGG通路分析技術(shù)發(fā)掘草麻黃中參與黃酮類化合物代謝途徑相關(guān)基因，為克隆草麻黃黃酮合成關(guān)鍵基因、黃酮類化合物的生物合成提供重要的遺傳資源，同時為其抗逆機(jī)制的研究和藥用價值開發(fā)提供依據(jù)。

草麻黃；轉(zhuǎn)錄組；高通量測序；黃酮類化合物

草麻黃(EphedrasinicaStapf)屬于麻黃科(Ephedraceae)麻黃屬(Ephedra)，是草本狀灌木植物，屬于超旱生、強(qiáng)旱生、旱生系列植物，根系發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)，四季常綠[1]。該屬植物在防風(fēng)固沙、增加植被覆蓋等方面具有重要作用，是河西和西北荒漠地區(qū)的主要建群種[1]。麻黃屬在我國有廣泛的分布，現(xiàn)已報道的有19種[2]，包括5個變種。在這19種麻黃植物中，草麻黃富含生物堿(主要為麻黃堿、偽麻黃堿)和黃酮類化合物[3-5]，具有重要的藥用價值，是中國特有的中草藥。其中黃酮類化合物是植物在長期的生態(tài)適應(yīng)過程中為抵御惡劣生態(tài)條件形成的一大類次生代謝產(chǎn)物，參與植物生態(tài)防御[6]，它廣泛存在于高等植物及羊齒植物的根、莖、葉、花、果實等[7]，數(shù)量種類繁多、結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣[8]。該類化合物具有抑制酶活性、抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎癥、抗過敏、抗糖尿病并發(fā)癥等功能，且無毒無害，對治療和預(yù)防腫瘤、衰老、心血管病等退變性疾病有重要意義[8-9]。

中國是全球天然麻黃的主要產(chǎn)地，內(nèi)蒙古、山西大部分地區(qū)均有較豐富的野生草麻黃資源[10]。近年來，人們由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使對草麻黃進(jìn)行了掠奪式的開發(fā)，導(dǎo)致麻黃資源日益匱乏。因此利用生物技術(shù)提高麻黃品質(zhì)、開發(fā)新的麻黃資源成為今后麻黃生產(chǎn)利用的發(fā)展方向。目前藥用植物黃酮類化合物的研究主要集中在提取工藝、成分分析及藥理活性方面[11]，同時分子生物學(xué)也開始涉及藥用植物的研究。藥用植物黃酮類化合物代謝合成途徑中的相關(guān)功能基因的研究主要集中在CHS(查耳酮合成酶)基因[12-13]、CHI(查耳酮異構(gòu)酶)基因[14-16]、IFS(異黃酮合成酶)基因[17]等。

隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，Groves等[18]利用RNA-seq技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平對草麻黃的麻黃生物堿(麻黃堿和假麻黃堿)合成途徑進(jìn)行了發(fā)掘，初步發(fā)現(xiàn)了合成相關(guān)化合物的關(guān)鍵基因和通路；然而，并未見其對黃酮類合成代謝途徑的報道。在鄧楠等[19]對中麻黃黃酮類代謝途徑的轉(zhuǎn)錄組水平初步鑒定的基礎(chǔ)上，為更好地了解麻黃屬植物中黃酮類代謝途徑，本研究以草麻黃為研究對象，利用NCBI中已有的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)，重新進(jìn)行組裝、拼接，獲得草麻黃的重組裝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并初步發(fā)掘了黃酮類化合物代謝途徑相關(guān)基因，為草麻黃中該途徑關(guān)鍵合成基因的克隆、其遺傳改良及藥用價值的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)來源

草麻黃轉(zhuǎn)錄組原始測序數(shù)據(jù)來自NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫，測序材料為草麻黃嫩梢(shoot)，平臺為Illumina Genome Analyzer II雙端測序，編號為ERR364402，大小為1.5 G。

1.2數(shù)據(jù)的拼接和組裝

首先將下載的raw reads進(jìn)行過濾，去除帶接頭的reads，去除N(N表示無法確定堿基信息)的比例大于10%的reads，去除低質(zhì)量reads(質(zhì)量值Qphred≤5的堿基數(shù)占總reads的50%以上)，獲得clean reads。再用Trinity[20]對clean reads進(jìn)行拼接，將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列transcript，作為后續(xù)分析的參考序列，鑒于Trinity拼接的算法和原理，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為unigene，以此進(jìn)行后續(xù)的分析。

1.3基因功能注釋

為獲得全面的基因功能信息，用Blast軟件將所獲得的unigene序列分別與Nr(非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫)、KOG(clusters of orthologous groups of proteins)和Swiss-prot比對(evalue<0.000 1)，進(jìn)行功能注釋和分類處理。再對unigene進(jìn)行GO(gene ontology)功能注釋和分類，并用WEGO軟件對GO注釋結(jié)果分類作圖，然后將unigene與KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，分析相關(guān)的代謝通路。

2　結(jié)果與分析

2.1草麻黃測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

草麻黃轉(zhuǎn)錄組測序統(tǒng)計共得到11 654 056 raw reads，7 947 954 clean reads。本次組裝的Q20值為84.72%，Q30值為58.41%，序列堿基GC含量為48.40%，堿基錯誤率為0.31%，說明草麻黃轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量相對較好，測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較高，能夠滿足后續(xù)分析研究的要求。

2.2草麻黃轉(zhuǎn)錄本組裝情況

從圖1可以看出：transcript和unigene長度分布結(jié)果一致，長度在200～500 bp的序列數(shù)量最多，分別為10 357(70.88%)和9 720(72.60%)；長度大于2 000 bp的數(shù)量最少，分別為64(0.44%)和55(0.41%)。transcript和unigene長度的平均值分別為465和453 bp，N50/N90分別為553 bp/238 bp和525 bp/235 bp(表1)。N50/N90值越大，反映組裝得到的長片段越多，組裝效果越好。以上結(jié)果表明，組裝的結(jié)果較好，可以用于后續(xù)分析和信息挖掘工作。

2.3基因功能注釋結(jié)果

2.3.1注釋結(jié)果統(tǒng)計

將草麻黃全部13 389條unigene序列分別與7個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，包括NR(NCBI官方蛋白序列數(shù)據(jù)庫，包括了GenBank基因的蛋白編碼序列)，NT(NCBI官方核酸序列數(shù)據(jù)庫，包括了GenBank，EMBL和DDBJ的核酸序列，但不包括EST，STS，GSS，WGS，TSA，PAT，HTG序列)，KO(系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物和化合物在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫)，GO(國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能描述的分類系統(tǒng))，Swiss-Prot(搜集了經(jīng)過有經(jīng)驗的生物學(xué)家整理及研究的蛋白序列)，PFAM(最全面的蛋白結(jié)構(gòu)域注釋的分類系統(tǒng))和KOG(NCBI的基于基因直系同源關(guān)系的真核生物蛋白數(shù)據(jù)庫)。由表2可知：在NR蛋白序列數(shù)據(jù)庫獲得注釋的unigene數(shù)量為10 481條，是獲得注釋最多的數(shù)據(jù)庫，占全部注釋序列的78.28%。值得注意的是，有1 240條(9.26%)unigene序列在7個數(shù)據(jù)庫都獲得注釋，至少在一個數(shù)據(jù)庫注釋成功的unigene數(shù)量為10 954條(81%)，表明本次注釋的結(jié)果較好，注釋的成功率較高。將草麻黃序列與其他物種進(jìn)行相似性比較，相似性最高的為松科的北美云杉[Piceasitchensis(Bong.) Carr.](38.1%)，其次為原始被子植物無油樟(AmborellatrichopodaBaill.)(6.5%)和海棗(PhoenixdactyliferaL.)(2.9%)等(圖2)。這也說明在進(jìn)化上麻黃屬與裸子植物云杉屬親緣關(guān)系更近些，而與被子植物親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。

圖1　草麻黃轉(zhuǎn)錄組unigene和transcipt數(shù)據(jù)長度分布圖Fig.1　Unigene and transcipt data length distribution for transcriptome of Ephedra sinica Stapf

表1草麻黃轉(zhuǎn)錄組的unigene和transcript數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量統(tǒng)計

Table 1Data assembly for unigene and transcript in transcriptome ofEphedrasinicaStapf

數(shù)據(jù)最大值平均值中間值N50N90總核苷酸Transcript長度/bp32244653365532386792993Unigene長度/bp32244533275252356060116

注：N50/N90為將拼接轉(zhuǎn)錄本按照長度從長到短排序，累加轉(zhuǎn)錄本的長度，到不小于總長50%/90%的拼接轉(zhuǎn)錄本的長度。

2.3.2草麻黃轉(zhuǎn)錄組GO分類結(jié)果

GO是一套國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能描述的分類系統(tǒng)。GO分為3大類，分別為B生物過程(biological process)，M分子功能(molecular function)和C細(xì)胞組分(cellular component)，分別用來描述基因編碼的產(chǎn)物所參與的生物過程、所具有的分子功能及所處的細(xì)胞環(huán)境。經(jīng)過GO數(shù)據(jù)庫分析后獲得33 540個注釋結(jié)果，其中生物過程15 527個，細(xì)胞組分9 703個，分子功能8 268個。圖3為草麻黃嫩梢基因表達(dá)的總體情況，其中獲得注釋最多的為生物過程部分，而生物過程部分獲得注釋最多的為B1(代謝過程)3 952個，占生物過程總數(shù)的25.45%。值得注意的是，黃酮類化合物代謝途徑正是B1(代謝過程)的一部分。關(guān)于黃酮類化合物代謝途徑所屬的次生代謝物代謝所占的比例則需要進(jìn)一步的KOG功能分類。同時，在B7(刺激響應(yīng))和B9(信號傳導(dǎo))也獲得了較多的GO注釋unigene，它們可能直接參與草麻黃的脅迫響應(yīng)過程，為研究草麻黃抗逆機(jī)制、提高草麻黃抗性奠定基礎(chǔ)。

表2Unigene注釋結(jié)果統(tǒng)計

Table 2Annotation for unigene ofEphedrasinicaStapf

蛋白數(shù)據(jù)庫獲得注釋的unigene總數(shù)百分比/%NR1048178.28NT265319.81KO513138.32SwissProt803960.04PFAM690151.54GO712153.18KOG453333.85

圖2　Nr數(shù)據(jù)庫比對上的物種分布圖Fig.2　Species distribution of Nr database

2.3.3草麻黃轉(zhuǎn)錄組KOG功能注釋

KOG(eukaryotic ortholog groups)注釋系統(tǒng)針對真核生物的基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫，目前共有4 852個分類。將13 389條unigene序列進(jìn)行KOG數(shù)據(jù)庫分析后獲得5 090個注釋結(jié)果，包括4個功能分類(圖4)。其中O類(蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、分子伴侶)獲得761個注釋結(jié)果，是獲得注釋最多的部分。黃酮類代謝途徑所屬的Q類(次生代謝產(chǎn)物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝)共獲得了208個注釋。而黃酮類化合物又包括黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃烷酮醇、異黃酮、異黃烷酮、查耳酮等。草麻黃轉(zhuǎn)錄組中涉及的具體次生代謝通路還需要進(jìn)一步的KEGG代謝通路分析。同時在T類(信號傳導(dǎo)機(jī)制)和V類(防御機(jī)制)分別獲得了354和53個注釋，這些注釋到的相關(guān)基因可能參與草麻黃的次生代謝物代謝和脅迫響應(yīng)過程，為改良麻黃品質(zhì)、提高麻黃抗性提供資源。

B:生物過程M:分子功能C:細(xì)胞組成B1 代謝過程B16 生物附著M1 結(jié)合C1 細(xì)胞B2 細(xì)胞過程B17 繁殖過程M2 催化活性C2 細(xì)胞組分B3 單一生物過程B18 繁殖M3 載體活性C3 細(xì)胞器B4 生物調(diào)節(jié)B19 免疫系統(tǒng)過程M4 結(jié)構(gòu)分子活性C4 高分子配合物B5 定位B20 生長M5 核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性C5 膜B6 生物過程調(diào)控B21 細(xì)胞殺傷M6 分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性C6 膜組分B7 刺激響應(yīng)B22 生物相M7 酶調(diào)節(jié)活性C7 細(xì)胞器組分B8 細(xì)胞組分組織或生物合成B23 節(jié)律性過程M8 蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活動C8 膜蛋白B9 信號傳遞M9 受體活性C9 胞外區(qū)B10 多生物過程M10 抗氧化活性C10 病毒B11 涉及多細(xì)胞有機(jī)體的過程M11 通道調(diào)節(jié)活性C11 胞外區(qū)組分B12 發(fā)育過程M12 受體調(diào)節(jié)活性C12 細(xì)胞外基質(zhì)B13 生物過程正調(diào)控M13 鳥嘌呤核苷酸交換因子活性C13 細(xì)胞外基質(zhì)組分B14 生物過程負(fù)調(diào)控M14 金屬伴侶蛋白活性C14 突觸B15 移動C15 突觸組分

圖3草麻黃轉(zhuǎn)錄組的unigene GO功能分類

Fig.3GO function classification of unigene in transcriptome ofEphedrasinicaStapf

A RNA加工和修改M 細(xì)胞壁/膜/包膜生物合成B 染色體結(jié)構(gòu)及動力系統(tǒng)O 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、分子伴侶C 能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換P 無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝D 細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分區(qū)Q 次生代謝產(chǎn)物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝E 氨基酸運(yùn)輸和代謝R 一般功能預(yù)測F 核苷酸運(yùn)輸和代謝S 未知功能G 碳水化合物運(yùn)輸和代謝T 信號傳導(dǎo)機(jī)制H 輔酶運(yùn)輸和代謝U 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和膜泡運(yùn)輸I 脂類運(yùn)輸和代謝V 防御機(jī)制J 翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化W 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)K 轉(zhuǎn)錄Y 核結(jié)構(gòu)L 復(fù)制、重組和修復(fù)Z 細(xì)胞骨架

圖4草麻黃轉(zhuǎn)錄組的unigene KOG功能分類

Fig.4KOG function classification of unigene in transcriptome ofEphedrasinicaStapf

2.3.4草麻黃轉(zhuǎn)錄組KEGG分類

KEGG數(shù)據(jù)庫涉及系統(tǒng)信息、基因組信息和化學(xué)信息，是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫。利用KEGG數(shù)據(jù)庫可以進(jìn)一步研究基因在生物學(xué)上的復(fù)雜行為，有助于進(jìn)一步研究特定基因的生物功能。將草麻黃轉(zhuǎn)錄組unigene序列與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共獲得5 833個注釋結(jié)果，涉及代謝通路可分為5大類：細(xì)胞過程(cellular processes)(659個，11.30%)，環(huán)境信息處理(environmental information processing)(465個，7.97%)，遺傳信息處理(genetic information processing)(1 235個，21.17%)，代謝(metabolism)(2 586個，44.33%)，生物系統(tǒng)(organismal systems)(888個，15.23%)(圖5)。其中，獲得注釋最多的為代謝部分的碳水化合物代謝，獲得562個注釋，最少的為環(huán)境信息處理的信號分子和相互作用，為5個注釋。在全部5 833個注釋結(jié)果中，涉及次生代謝物代謝的unigene共288個，其中黃酮類化合物代謝相關(guān)基因共70個，包括類黃酮代謝相關(guān)基因56個，異黃酮代謝相關(guān)基因1個，黃酮和黃酮醇代謝相關(guān)基因13個(表3)。這說明本研究從草麻黃轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘到了較豐富的次生代謝相關(guān)基因，其中黃酮類不僅具有重要的藥用價值，還可能參與草麻黃的脅迫響應(yīng)。這些unigene序列為今后草麻黃的次生代謝遺傳工程研究提供了遺傳資源，也展現(xiàn)出了高通量測序技術(shù)鑒定代謝途徑相關(guān)基因的實用性。

2.4草麻黃轉(zhuǎn)錄組中黃酮類化合物代謝相關(guān)基因發(fā)掘

植物在長期的進(jìn)化過程中與其生存環(huán)境相互作用，并根據(jù)初生生長的需要產(chǎn)生各種類型的次生代謝物[21]，在這些次生代謝物中，黃酮類化合物是植物在生態(tài)適應(yīng)過程中為抵御惡劣生態(tài)條件而形成的，并參與植物生態(tài)防御、擔(dān)當(dāng)生殖過程的信使[22]。黃酮類化合物種類繁多，主要分為黃酮醇(flavonols)、黃酮(flavones)、異黃酮(isoflavones)和花色素苷(anthocyanins)等[23]，并且，這些化合物在細(xì)胞內(nèi)的合成過程發(fā)生在不同位置[24]。從KEGG分析可以看出，共獲得黃酮類化合物代謝相關(guān)基因70個，表3列出了獲得的代謝通路相關(guān)的unigene和注釋信息，注釋基因較多的為類黃酮代謝通路，代謝通路中注釋的關(guān)鍵基因的位置和數(shù)量如圖6所示。草麻黃黃酮類化合物合成的前體是簡單酚類，其中PAL催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸，從而提供了初生代謝和苯丙烷代謝途徑之間的代謝聯(lián)系。查爾酮合成酶(CHS)是接下來過程的第一個關(guān)鍵酶，將苯丙烷代謝途徑引向黃酮類化合物的合成。CHS是苯丙烷系代謝途徑中含量最豐富的酶之一，但該酶的催化效率較低，其轉(zhuǎn)錄受到高濃度肉桂酸的抑制及高濃度香豆酸的促進(jìn)[25]。接下來步驟中的關(guān)鍵酶是查爾酮異構(gòu)化酶(CHI)，催化查爾酮合成柚皮素、二氫黃酮、無花色素等代謝物。黃酮醇合成酶(FLS)是黃酮醇合成代謝支路的關(guān)鍵酶，由此可合成槲皮素、楊梅素等具有藥用價值的代謝物。本次草麻黃轉(zhuǎn)錄組鑒定闡明了草麻黃黃酮類化合物的生物合成途徑并鑒定了關(guān)鍵酶的基因，為進(jìn)一步研究次生代謝調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。這些基因的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步克隆其全長、研究其功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時也為草麻黃黃酮類化合物的生物合成研究奠定了基礎(chǔ)。本研究為應(yīng)用生物技術(shù)方法獲取草麻黃有效成分或其中間體提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

G遺傳信息處理C細(xì)胞過程B生物系統(tǒng)E環(huán)境信息處理M代謝G1 翻譯C1 運(yùn)輸和代謝B1 內(nèi)分泌系統(tǒng)B7 排泄系統(tǒng)E1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)M1 碳水化合物代謝M7 其他氨基酸的代謝G2 折疊,分類和降解C2 細(xì)胞生長和死亡B2 神經(jīng)系統(tǒng)B8 發(fā)育E2 膜轉(zhuǎn)運(yùn)M2 能量代謝M8 核苷酸代謝G3 轉(zhuǎn)錄C3 細(xì)胞共同體B3 環(huán)境的適應(yīng)B9 感官系統(tǒng)E3 信號分子和相互作用M3 氨基酸代謝M9 萜類和酮類化合物的代謝G4 復(fù)制和修復(fù)C4 細(xì)胞運(yùn)動B4 免疫系統(tǒng)M4 脂質(zhì)代謝M10外來物質(zhì)的降解和代謝B5 消化系統(tǒng)M5 輔酶因子和維生素代謝M11多糖的生物合成與代謝B6 循環(huán)系統(tǒng)M6 其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成

圖5草麻黃轉(zhuǎn)錄組的unigene KEGG代謝途徑分類

Fig.5KEGG classification of unigene in transcriptome ofEphedrasinicaStapf

表3草麻黃轉(zhuǎn)錄組黃酮類化合物合成途徑中的相關(guān)基因

Table 3Flavonoid biosynthesis related gene in transcriptome ofEphedrasinicaStapf

KO編號基因名稱(英)基因名稱(中)簡寫unigene序列編號黃酮和黃酮醇代謝通路ID:ko00944K05279Flavonol3-O-methyltransferase黃酮醇3’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶AtOMT1c10359_g1/c14996_g1/c14842_g1/K13083flavonoid3',5'-hydroxylase類黃酮3’,5’-羥化酶F3’5’Hc15359_g1/c10385_g1/c14503_g1/c12500_g1/c14398_g1/c12713_g1/K05280flavonoid3'-monooxygenase類黃酮3’-單加氧酶F3’Mc13173_g1/c7848_g1/c12719_g1/c5787_g1/類黃酮代謝通路ID:ko00941K13065ShikimateO-hydroxycinnamoyltrans-ferase莽草/荃寧酸酯轉(zhuǎn)移酶HCTc7180_g1/c8816_g1/c10714_g1/c15475_g1/c8271_g1/c8791_g1/c5331_g1/c2415_g1/c11452_g1/K08695anthocyanidinreductase花青素還原酶ANRc10675_g1/c4165_g1/c13516_g1/c15063_g1/c14552_g1/K13083flavonoid3',5'-hydroxylase類黃酮3’,5’-羥化酶F3’5’Hc15359_g1/c10385_g1/c14503_g1/c12500_g1/c14398_g1/c12713_g1/K13082Bifunctionaldihydroflavonol4-reduc-tase/flavanone4-reductase二氫黃酮醇4-還原酶/黃酮4-還原酶DFRc8210_g1/c11065_g1/c13223_g1/c13781_g1/c11906_g1/c2285_g1/c13195_g1/c9960_g1/c8567_g1/K13081leucoanthocyanidinreductase無色花青素還原酶LARc9454_g1/c8813_g1/

續(xù)表3

圖6　草麻黃黃酮代謝通路Fig.6　Flavonoids metabolic pathway of Ephedra sinica Stapf

3　討論

草麻黃作為麻黃屬中重要的藥用植物、牧草品種和荒漠建群物種，其分子遺傳方面的研究還處于空白狀態(tài)，嚴(yán)重影響草麻黃的研究和利用。為了彌補(bǔ)這一空白，充分利用數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)資源，本研究對NCBI中SRA數(shù)據(jù)庫中的草麻黃轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)組裝以及注釋，獲得了13 389條unigene序列，平均長度為453 bp，對比麻黃屬中其他物種的轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果，如中麻黃(E.intermedin)轉(zhuǎn)錄組的unigene平均長度為482 bp，N50為612 bp[19]，膜果麻黃(E.przewalskii)轉(zhuǎn)錄組的unigene平均長度為517 bp，N50為663 bp[26]。說明了本次數(shù)據(jù)組裝的效果較好，獲得了大量的遺傳信息，為草麻黃這類基因組圖譜尚未完成且遺傳數(shù)據(jù)信息相對匱乏的非模式物種提供了良好的研究基礎(chǔ)。

本研究對草麻黃轉(zhuǎn)錄組的鑒定，除了獲得了CHS(查耳酮合成酶)基因、CHI(查耳酮異構(gòu)酶)基因、IFS(異黃酮合成酶)基因、F3H(黃烷酮3羥化酶)基因、FLS(黃酮醇合成酶)基因、DFR(二氫黃酮醇還原酶)基因等研究較多且在黃酮類代謝途徑中具有關(guān)鍵作用的基因以外，還獲得了其他重要的基因，如肉桂酸合成關(guān)鍵基因PAL、槲皮素合成關(guān)鍵基因F3’5’H、黃酮合成關(guān)鍵基因FNS等。并且與中麻黃種子萌發(fā)期間黃酮類化合物合成途徑相關(guān)基因相比[19]，中麻黃種子萌發(fā)期間黃酮類合成涉及的基因家族在本次草麻黃注釋中均獲得，但注釋的基因數(shù)量不同。IF7G(isoflavone 7-O-glucosyltransferase，異黃酮7-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶)和FMT(flavonol 3-O-methyltransferase，黃酮醇3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶)僅在草麻黃轉(zhuǎn)錄組中有注釋，而在中麻黃中并沒有注釋，其原因可能是組織特異性引起的，也可能是這2個基因具有種間特異性，這還需后續(xù)研究進(jìn)一步鑒定。其中，IF7G是異黃酮代謝過程所特有的基因，異黃酮對人體有重要的作用，不僅具有抗氧化和抗腫瘤活性，還能預(yù)防心血管疾病和骨質(zhì)疏松癥[27-29]。但異黃酮在植物體內(nèi)含量較低，目前的研究發(fā)現(xiàn)，天然的大部分異黃酮僅分布于豆類中，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類的需求，通過化學(xué)手段合成異黃酮工藝較復(fù)雜、成本高，因此通過基因和代謝工程手段提高植物異黃酮的含量具有誘人的前景。雖然目前異黃酮合酶已經(jīng)在非豆科植物中轉(zhuǎn)化成功，但是轉(zhuǎn)基因植株累積的異黃酮含量僅為普通大豆的20%～40%[30]。本研究中草麻黃IF7G基因的獲得為IF7G基因的克隆及異黃酮的代謝遺傳工程研究提供了重要的基因資源。

黃酮類化合物等植物次生代謝機(jī)制一直是十分活躍的前沿研究領(lǐng)域，這也是目前了解的最為清楚的植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑。植物藥以其天然低毒的特點倍受青睞，而黃酮類化合物更是以其藥理作用引人矚目，開發(fā)利用植物的天然黃酮化合物已經(jīng)成為目前的研究熱點。另外，黃酮類化合物是植物在長期的生態(tài)適應(yīng)過程中抵御外界惡劣生態(tài)條件、動物、微生物的攻擊而產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，參與植物生態(tài)防御，提高植物在某些逆境脅迫中的抗性。草麻黃作為生長在干旱、鹽堿地等極端條件下的植物，具有非常強(qiáng)的抗旱、耐鹽堿、抗病等能力，具有較高的研究價值。本研究獲得的草麻黃黃酮類等其他次生代謝物的相關(guān)基因，為克隆草麻黃中的黃酮合成關(guān)鍵基因提供了基礎(chǔ)，為更好地研究其抗逆機(jī)制和藥用價值以及開發(fā)提供了寶貴的遺傳資源。

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(責(zé)任編輯侯春曉)

Characterization of transcriptome reveals pathway of flavonoids in Ephedra sinica Stapf

MA Jing1， CHENG Tie-long1，2，*， SUN Can-yue3， DENG Nan1， SHI Sheng-qing1， JIANG Ze-ping1

(1.KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivation，StateForestryAdministration/ResearchInstituteofForestry，ChineseAcademyofForestry，Beijing100091，China; 2.CollegeofBiologyandtheEnviroment，NanjingForestryUniversity,Nanjing210037，China; 3.NanningTreeGarden，Nanning530031,China)

EphedrasinicaStapf is not only an important medicinal plant rich in flavonoids and alkaloids， but also an important sand-fixing plant in the desert environment. In this study， the transcriptome ofE.sinicafrom SRA database in GenBank was further analyzed by bioinformatics method. 7 947 954 clean reads and 13 389 unigenes were acquired after de novo assembly; 10 481 annotations were acquired from Nr database， 4 533 from KOG database， 7 121 from GO database， 5 833 from KEGG database， 8 039 from Swiss-Prot database after function annotation against five databases. We also discovered a series of unigenes which were associated with flavonoids biosynthesis by KEGG pathway analysis， which benefits the cloning of related genes and biosynthesis of related components in flavonoids pathway. This study could provide

for understanding the resistance mechanism ofE.sinicaand utilization of its medicinal value in the future studies.

EphedrasinicaStapf; transcriptome; high-throughput sequencing; flavonoids

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.11

2015-08-05

林木遺傳育種國家重點實驗室專項(CAFYBB2012040)；國家自然科學(xué)基金資助項目(31270707)

馬婧(1990—)，女，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向為抗逆分子生物學(xué)。E-mail: majing19900121@sina.com

，成鐵龍，E-mail：ctielong@126.com

S567.239

A

1004-1524(2016)04-0609-09

馬婧， 成鐵龍， 孫燦岳， 等. 草麻黃高通量轉(zhuǎn)錄組分析及黃酮類代謝途徑相關(guān)基因的鑒定[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2016， 28(4): 609-617.