萬載黑兔微衛星標記的遺傳多樣性分析

黃江南，劉林秀，季華員，謝金防，周泉勇，熊立根，韋啟鵬

(江西省農業科學院 畜牧獸醫研究所，江西 南昌 330200)

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萬載黑兔微衛星標記的遺傳多樣性分析

黃江南，劉林秀，季華員，謝金防，周泉勇，熊立根，韋啟鵬*

(江西省農業科學院 畜牧獸醫研究所，江西 南昌 330200)

對萬載黑兔、皖系長毛兔和比利時兔進行遺傳多樣性檢測。利用13個微衛星位點，進行哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢驗，統計3個種群的基因頻率、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、F值和遺傳距離。研究結果表明：萬載黑兔、比利時兔、皖系長毛兔各存在3個不平衡位點，說明群體遺傳多樣性較豐富。3個群體多態信息含量(PIC)平均值分別為0.35，0.48，0.31。3個群體的He平均值分別為0.40，0.54，0.37；Ho平均值分別為0.39，0.51，0.35。群體間遺傳分化系數(Fst)平均為0.120 1，萬載黑兔與比利時兔的遺傳距離最近，為0.145 2；皖系長毛兔與萬載黑兔的遺傳距離最遠，為0.200 0。

萬載黑兔；皖系長毛兔；比利時兔；微衛星標記；遺傳多樣性

萬載兔是江西省優良地方兔遺傳資源，具有抗逆性強，耐粗飼，產仔率高，肉質好等優點[1]。作為最早列入國家畜禽遺傳資源名錄中的四大地方家兔品種之一，與我國其他地方兔品種相比，萬載兔最具特色的是其兔毛粗短而緊密，絨毛少，非常適應南方高溫高濕的氣候，是少有的能適應南方氣候的肉兔品種。按體型劃分，萬載兔可分為兩種：體型小的為“火兔”，毛色以黑為主(又稱萬載黑兔)；體型大的為“木兔”，毛色為麻色(又名萬載麻兔)。多年來，萬載兔因其優良生產性能一直是江西省肉兔養殖的主要品種之一。

微衛星DNA，亦稱簡單序列重復，其廣泛分布于各種真核生物基因組中，具有種特異性和家系特異性，是目前使用最為廣泛的第二代分子標記技術之一，在度量品種遺傳多樣性、估測品種間遺傳距離及構建系統發生樹等研究中顯示出了巨大的優勢[2-3]。相對于國外，我國家兔分子生物學標記的研究起步較晚，但近年來發展較快。樊兆斌等[4]利用微衛星標記開展了新西蘭兔、加利福尼亞兔、德國大白兔、比利時兔、日本大耳白兔等5個引進品種的多態性研究，朱玉峰等[5]對獺兔等幾個品種的系統發生關系進行了分析。地方家兔資源研究方面，謝喜平等[6-7]先后利用微衛星標記對福建黃兔、閩西南黑兔開展了遺傳多樣性分析，劉春等[8]開展了新西蘭白兔和福建黃兔的微衛星多態性比較。但有關萬載兔群體遺傳多樣性的微衛星標記的相關研究，現尚少見報道。

本研究選取多態性較好的13個微衛星標記，檢測比較包括萬載黑兔在內的3個兔品種的微衛星多態性，從分子水平探討萬載兔的遺傳多樣性，旨在為萬載兔的保種選育、培育新品種(系)和經濟雜交利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1組織樣品采集及DNA提取

3個兔品種的名稱、數量及采樣地點見表1，基本上公母各半。采取兔耳組織樣品，于體積分數為75%的乙醇中儲存帶回實驗室，-20 ℃備用，基因組DNA的提取采用常規酚/氯仿法提取。用NanoDrop ND-2000濃度測定儀測定其濃度和純度后于4 ℃保存備用。

表1三個兔品種的名稱、數量和采樣地點

Table 1Name， sample size and collecting locations of three rabbit breeds

編號家兔名稱數量/只采樣地點WB萬載黑兔37江西省萬載兔原種場B比利時兔19安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所種兔場WL皖系長毛兔32安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所種兔場

1.2儀器及試劑

東勝龍黑金剛EDC-810 PCR儀購自北京東勝創新生物科技有限公司，3730XL基因測序儀購自ABI分司，Allegra 25R臺式高速冷凍離心機購自Beckman(貝克曼)公司；Taq酶和dNTP購自Fermentas公司，ROX-500 Size Standard購自Fermentas公司，熒光引物由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。

1.3SSR引物篩選及QF-PCR 擴增

根據GenBank和文獻[6，9-10]上提供的兔SSR序列及引物進行位點篩選。選擇核心重復序列較多，且在多個兔品種中多態性豐富的位點。引物(表2)由上海鉑尚生物有限公司合成。

表2十三個微衛星位點引物的信息

Table 2Basic information of 13 microsatellite primers

基因座引物序列(5’-3’)片段長度/bp退火溫度/℃5L1E8CCAGCTGGTAATAGTAGAGAAAGGCATTTGTGGAGTGAA208～238567L1B10TTGGCAGGAAGAAAAG-GAAGATTTTTGTCATAAGCATTTGG-GAAGTG183～1925912L4A1GCTAATTACCCAAAGGAA-CATACACAGTGCAAATTTGGAAGGTCT158～1755912L5A6GGTGTGAACCACTAGATAGAACAAAATTAGGTCCCTTGTAGT247～2565612L1E11AGTGGTAGCGCTTTGGTCTGGCTCCTTGGGGCATTTG222～2305619L1G5AGTTGCTCCCACCCGATTTTATGCTGTTGGGAGTAGATT-GACC133～1435612L1C2AGGGGCCTCCATCCTCTACAATTATGTGTCAGGCAGGCT-GTGTC173～18458D6L2H3CAAATGAAATGAGGAGG-GAGATACATTGAGGACATTTGAG-TAGTGAG132～15556SAT5GCTTCTGGCTTCAACCTGACCTTAGGGTGCAGAATTATA-AGAG209～23258SAT13CAGTTTTGAAGGACACCTGCGCCTCTACCTTTGTGGGG112～12656SOL30CCCGAGCCCCAGATATTGT-TACCATGCAGCACTTCATAGTCT-CAGGTC145～16456SOL33GAAGGCTCTGAGATCTAGATGGGCCAATAGGTACTGATC-CATGT208～21556SOL44GGCCCTAGTCTGACTCTGAT-TGGGTGGGGCGGCGGGTCT-GAAAC204～21958

PCR反應體系為20 μL，分別為：10×Buffer 2.0 μL，50 ng·μL-1DNA 1.0 μL，3 mmol·L-1Mg2+0.6 μL，2 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，1×16.67 mkat·L-1Taq酶0.2 μL，0.5 pmol·μL-1上下游引物(含FAM)各1.0 μL，ddH2O 12.2 μL。擴增反應程序如下：95 ℃ 預變性2 min，94 ℃變性30 s，根據基因引物Tm值設定退火溫度(50～60 ℃)，退火50 s，72 ℃延伸1 min共40個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產物檢測，含熒光標記的PCR產物用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動測序儀檢測。上樣總體積為11.5 μL，其中上樣液Hi-Di Formamide 10.0 μL與ROX-500 Size Standard (標準內參)0.5 μL，PCR產物1.0 μL。

1.4數據統計分析

采用GeneMapper 4.0導出圖譜文件，根據圖譜中最大波峰位置判斷目標條帶的大小，單波峰為純合子，雙峰為雜合子，并生成Excel數據表格。利用microsatellite-toolkit軟件計算等位基因雜合度(heterozygosity，H)、多態信息含量(polymorplism information content，PIC)。用Popgene32軟件進行-哈代溫伯格平衡檢驗、3個群體Nei氏標準遺傳距離及相似性分析。運用SPSS 17對3個品種間的遺傳多樣性指標進行差異顯著性分析。

2　結果與分析

2.1微衛星擴增結果及多態性

ABI-3730XLDNA Analyzer全自動測序儀對所檢位點進行掃描。圖1-A為位點7L1B10在萬載黑兔4號樣的基因型為183/183。圖1-B為位點12L1E11在萬載黑兔3號樣的基因型為228/228。

A： 位點7L1B10在萬載黑兔4號樣品中的分型；B： 位點12L1E11在萬載黑兔3號樣品中的分型。圖1　位點7L1B10和12L1E11的某個分型Fig.1　One of genotyping of microsatallite 7L1B10 and 12L1E11 locus in Wanzai black rabbits

2.2三個品種間各位點優勢基因比較

優勢等位基因是群體中最穩定的基因，某種程度上體現了群體特征[11]，通過分子手段檢測優勢等位基因在群體中的變化，可以推測群體的遺傳結構變化。比較3個群體在各位點的優勢等位基因頻率(表3)，分別對3個群體的優勢等位基因頻率進行顯著性分析。檢驗結果為PWB∶B=0.074，PWB∶WL=0.26，PB∶WL=0.708，即萬載黑兔、比利時兔和皖系長毛兔在13個微衛星標記位點的優勢等位基因頻率上的差異不顯著。

2.3各個品種間各個基因位點的遺傳多樣性

各微衛星位點的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、多態信息含量(PIC)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)值見表4。其中PIC和He是衡量群體遺傳多樣性的重要指標。在本研究的3個群體中PIC為0～0.73，其中位點12L5A6和19L1G5為低度多態，其余的呈中高度多態；3個群體PIC平均值分別為0.35，0.48和0.31，經F檢驗，比利時兔和皖系長毛兔之間差異顯著，其他群體間差異均不顯著(PWB∶B=0.13，PWB∶WL=0.64，PB∶WL=0.05)。He平均值分別為0.40，0.54和0.37，經F檢驗，各個群體之間的He值差異不顯著(PWB∶B=0.11，PWB∶WL=0.80，PB∶WL=0.07)。

表3三個群體優勢等位基因及頻率比較

Table 3Comparison of the dominant alleles and their frequencies among three rabbits breeds

基因座優勢等位基因大小/bp優勢等位基因頻率/%WBBWL5L1E820880.5621.0520.007L1B1018556.7650.00100.0012L4A116485.1447.3761.2912L5A625698.6581.5896.7712L1E1122886.4936.8467.7419L1G5143100.0094.7498.3912L1C218016.2234.2164.52D6L2H313452.7031.589.68SAT522881.0876.3229.03SAT1312682.4381.5856.67SOL3014570.2713.1635.48SOL3321556.7668.4298.33SOL4421150.0042.1153.23

注：WB為萬載黑兔，B為比利時兔，WL為皖系長毛兔。下同。

2.4三個群體的遺傳變異

在F統計量中，Fst<0.05表示品種遺傳分化程度較弱，Fis<0表示觀察雜合度過剩[8]。由表5可知：13個位點的Fst值19L1G5，12L1C2和SOL44等3個位點小于0.05，平均值為0.120 1，表明群體間遺傳變異較大；有6個位點Fis<0，平均值為0.028 9，表明部分位點呈現雜合子過剩。

對3個品種各個位點進行哈代-溫伯格檢驗，萬載黑兔(WB)存在3個不平衡位點，比利時兔存在3個不平衡位點，皖系長毛兔存在3個不平衡位點。

表4三個兔群體中的等位基因數，有效等位基因數、基因雜合度、多態信息含量

Table 4Allele numbers， effective alleles， observed heterozygosity， expected heterozygosity and polymorphic information content in three rabbit breeds

基因座WBNaNePICHoHeBNaNePICHoHeWLNaNePICHoHe5L1E83.001.500.310.110.345.003.950.700.320.774.002.980.620.130.687L1B104.002.370.510.510.593.002.640.550.740.641.001.000.000.000.0012L4A12.001.340.220.240.264.002.680.560.530.642.001.900.360.580.4812L5A62.001.030.030.030.033.001.450.270.260.322.001.070.060.060.0612L1E113.001.320.230.270.254.002.880.580.740.673.001.840.380.450.4619L1G51.001.000.000.000.002.001.110.090.000.102.001.030.030.030.0312L1C25.004.310.740.860.785.004.600.730.890.794.003.580.480.580.53D6L2H35.002.960.580.650.646.004.570.700.680.767.001.900.430.480.47SAT52.001.410.260.320.314.001.550.360.320.403.002.130.380.520.46SAT132.001.410.250.350.293.001.450.270.320.322.001.970.370.530.50SOL304.001.880.430.490.473.002.290.490.740.583.002.060.420.450.52SOL333.002.210.460.510.563.001.930.430.420.492.001.030.030.030.03SOL443.002.650.550.700.633.002.190.440.630.565.002.350.490.650.58平均值3.001.950.350.390.403.692.560.480.510.543.081.910.310.350.37

表5三個群體在13個基因位點的哈代-溫伯格檢驗

Table 5Hardy-Weinberg equilibrium test of three breeds

基因座FisFitFstWBP值HWBP值HWWLP值HW5L1E80.67850.73940.18930.0000**0.0004**0.0000**7L1B10-0.04130.12480.15950.3861NS0.3959NS——12L4A10.00360.08240.07910.7501NS0.2899NS0.2404NS12L5A60.10870.17460.07401.0000NS0.7504NS0.8551NS12L1E11-0.08000.11070.17660.7026NS0.7664NS0.6675NS19L1G50.75460.75990.0216——0.0024**1.0000NS12L1C20.06290.10360.04330.0338*0.0473*0.0000**D6L2H30.05170.20430.16090.0004**0.0537NS0.3390NSSAT5-0.4078-0.26520.10130.1083NS0.8737NS0.0000**SAT13-0.1018-0.01700.07690.1083NS0.2155NS0.7047NSSOL30-0.08280.11080.17890.5465NS0.1897NS0.8818NSSOL330.08790.20770.13130.4695NS0.4225NS1.0000NSSOL44-0.1376-0.09820.03460.4635NS0.2554NS0.8818NS平均值0.02890.14560.1201

注：HW為哈代-溫伯格平衡；NS為非顯著水平(P>0.05)。*為顯著水平(P<0.05)；**為極顯著水平(P<0.01)。

由表6可知：萬載黑兔與皖系長毛兔的相似性最小，為0.818 8；皖系長毛兔與萬載黑兔的遺傳距離最大，為0.200 0。這符合品種間的變化趨勢，國內外品種間的相似性較低，選育品種與本地種質資源地方品種遺傳距離較遠。

表6三個群體的Nei氏遺傳距離及相似性系數

Table 6Nei’s genetic identity and genetic distance in three rabbit breeds

WLBWBWL****0.85780.8188B0.1534****0.8649WB0.20000.1452****

注：對角線以上是Nei氏相似性系數，對角線以下為Nei氏遺傳距離。****表示同一群體不作比較。

3　討論

江西萬載兔是江西省地方優良品種，已列入國家級畜禽遺傳資源目錄。研究分析其遺傳資源的多樣性是進行本品種保護和開發利用的基礎，對地方優良品種的選育提高，培育新品種、新品系具有參考意義。微衛星DNA標記具有很多優點，如信息含量高、分布均勻且廣泛、多態性豐富、分析簡單等，微衛星DNA標記是一種非常有效的分析生物群體遺傳多樣性的手段，是當前進行人類和動物品種鑒定、個體識別的重要手段[12]。

多態信息含量(PIC)是等位基因頻率和等位基因數的變化函數，是衡量基因片段多態性較好的指標。多態信息含量越大，在1個群體中，該座位上雜合子比例則越大，提供的遺傳信息就越高[10]。根據Bostein等[13]提出的衡量多態信息量高低的指標，PIC>0.5時，為高度多態位點；0.5>PIC>0.25時，為中度多態位點，當PIC<0.25時，為低度多態位點。本研究所選取的13個微衛星標記位點，12L1C2位點的平均多態信息含量最高為0.65，最低的是19L1G5位點，為0.04。除SOL44，D6L2H3，5L1E8為高度多態位點，12L5A6和19L1G5微衛星為低度多態位點之外，其余均為中度多態位點。所以本研究所選的13個微衛星位點可以較好地用來做群體間遺傳多樣性的分析。

同一微衛星座位在不同的品種(系)間以及同一品種在不同微衛星座位上的多態信息含量差異較大。品種間的差異反映了不同兔品種間遺傳多樣性之間的差異，如5L1E8位點在萬載黑兔中的多態信息含量(PIC)為0.31，在皖系長毛兔中的多態信息含量(PIC)為0.62，反映了萬載兔與選育品系遺傳多樣性之間存在較大的差異。而同一品種不同的微衛星座位之間的差異，例如比利時兔在5L1E8位點的多態信息含量為0.70，而在19L1G5位點則為0.09，這種差異可能是該品系在選育過程中，不同微衛星座位所受的選擇壓的差異造成的。

一般認為，雜合度(heterozygosity，H)是度量群體遺傳變異的一個最適參數，又稱基因多樣度，反映群體在多個基因座位上的遺傳變異。雜合度越高，表明該群體的遺傳變異越多，群體的遺傳多樣性越高。群體雜合度越低，表明該群體的遺傳一致性越高，而群體的遺傳變異越少，群體遺傳多樣性越低[14]。期望雜合度(He)是從一個基因庫中隨機抽出為非純合基因的概率，此雜合度值越大，群體內的遺傳變異就越大。萬載黑兔、比利時兔和皖系長毛兔He平均值分別為0.40，0.54和0.37，說明萬載黑兔、比利時兔和皖系長毛兔存在較豐富的遺傳變異，其中比利時兔的近交程度較弱，具有豐富的遺傳多樣性。

另外，觀察雜合度值(Ho)與期望雜合度(He)值相差越小，說明該品種受外來選擇，近交等因素的影響越小，群體處于遺傳平衡狀態[15]，本研究中觀察雜合度值接近期望雜合度值，萬載黑兔、皖系長毛兔、比利時兔各存在3個位點顯著偏離HWE，其余位點，P>0.05，均符合HWE，表明了3個種群的遺傳結構均具有遺傳穩定性和均一性。

遺傳分化系數(Fst)是反映群體間遺傳分化的重要指標Fst值介于0～0.05之間說明種群間分化很弱，0.05～0.15表示中等分化，0.15～0.25表示分化大[16]。F值統計結果表明：3個兔群體的平均Fst為0.120 1，即12.01%的遺傳變異是由品種間差異形成，87.99%來自群體內部的遺傳多樣性，3個種群間呈現中等程度的遺傳分化。

遺傳距離是研究物種遺傳多樣性的基礎，它反映了所研究群體的系統進化，用來描述群體的遺傳結構和品種間的差異。如萬載黑兔與皖系長毛兔的相似性最小，為0.8188，皖系長毛兔與萬載黑兔的遺傳距離最大，為0.2000，皖系長毛兔是以德系安哥拉兔、新西蘭白兔2個品種間雜交以及20余年的繼代選育而成，屬中型粗毛型長毛兔。長毛兔為毛用兔，與其他群體交流較少，另外，皖系長毛兔為選育品種，也證明了選育品種與本地種質資源地方品種遺傳距離較遠。

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(責任編輯盧福莊)

Analysis on genetic diversity of Wanzai black rabbit based on microsatellite markers

HUANG Jiang-nan， LIU Lin-xiu， JI Hua-yuan， XIE Jin-fang， ZHOU Quan-yong， XIONG Li-gen， WEI Qi-peng*

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience，JiangxiAcademyofAgriculturalSciences，Nanchang330200，China)

Genetic diversities of Wanzai black rabbit， Wanxi Angora rabbit and Belgian rabbit were studied using 13 microsatellite markers. The genetic diversity was disclosed by calculating the allele frequency， heterozygosity (Ho)， expected heterozygosity (He)， F value and genetic distance. It was shown that there were 3 imbalance locus in each of the above mentioned rabbit populations， indicating a rich genetic diversity. The average polymorphism information contents (PIC) of Wanzai black rabbit， Wanxi Angora rabbit and Belgian rabbit were 0.35， 0.48， 0.31， respectively. The average He were 0.40， 0.54， 0.37， respectively， and the average Ho were 0.39， 0.51， 0.35， respectively. The average genetic differentiation coefficient (Fst) value among populations was 0.120 1. The observed closest genetic distance was 0.145 2 between Wanzai black rabbit and Belgian rabbit， and the observed farthest genetic distance was 0.200 0 between Wanzai black rabbit and Wanxi Angora rabbit.

Wanzai black rabbit; Wanxi Angora rabbit; Belgian rabbit; microsatellite markers; genetic diversity

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.06

2015-08-18

江西省農業科學院博士啟動基金(2011CBS009)

黃江南(1984—)，女，江西南昌人，助理研究員，博士，主要從事畜禽遺傳育種與繁殖研究。E-mail: huangjiangnan@webmail.hzau.edu.cn

，韋啟鵬，E-mail: weiqp66@sina.com

S829.1

A

1004-1524(2016)04-0574-06

黃江南，劉林秀，季華員，等. 萬載黑兔微衛星標記的遺傳多樣性分析[J]. 浙江農業學報，2016，28(4): 574-579.