南方型紫花苜蓿葉片鹽脅迫應答轉錄因子鑒定與分析

裴翠明，張振亞，馬　進

(浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 臨安 311300)

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南方型紫花苜蓿葉片鹽脅迫應答轉錄因子鑒定與分析

裴翠明，張振亞，馬進*

(浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 臨安 311300)

以南方型紫花苜蓿‘Millennium’為材料，以正常培養(WT_CK2)和250 mmol·L-1NaCl脅迫下72 h時(WT_N2)條件下的2個樣品葉片進行轉錄組分析，鑒定紫花苜蓿葉片鹽脅迫應答轉錄因子基因。同時隨機挑選4個轉錄因子差異表達基因進行實時熒光定量qRT-PCR驗證RNA-Seq結果的可靠性。紫花苜蓿葉片在250 mmol·L-1NaCl脅迫下72 h時，檢測到表達量差異達到2倍以上的基因共7 497個，其中包括隸屬于46個轉錄家族474個轉錄因子在鹽脅迫下的差異表達，上調242個，下調232個。bHLH，NAC，WRKY和C2H2轉錄家族成員基因70%以上表達上調。實時熒光定量PCR分析表明4個隨機選擇的基因在脅迫前后的表達特點與表達譜測序結果一致。此外，還發現大量紫花苜蓿鹽脅迫應答的轉錄因子候選基因如MsERF110，MsERF071，MsbHLH36，MsZFP，MsHSFB-3，MsMYB，MsNAC和MsWRKY等。同時，也揭示了紫花苜蓿葉片對鹽脅迫響應可能是多種轉錄因子家族共同參與的應答過程。

南方型紫花苜蓿；轉錄因子；葉片轉錄組；鹽脅迫

植物鹽脅迫是一種綜合脅迫，包括生理性干旱脅迫、滲透脅迫以及離子毒害脅迫，涉及到信號傳遞、多基因的協同控制、蛋白質翻譯與表達等一系列復雜的分子調控網絡。然而由于對植物耐鹽機理的認識不夠，且現有可用耐鹽基因的種類較少，限制了植物耐鹽育種的發展。基因對鹽脅迫應答主要表現在自身遺傳物質的基因控制，其中部分差異表達基因在耐鹽應激調控過程中發揮重要作用。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)主要分布在溫帶地區，除了作為牧草外，也是一種很好的水土保持綠化植物。近年來，國外高秋眠級紫花苜蓿品種引進解決了南方的種植難題，但紫花苜蓿耐鹽能力有限，限制了在南方鹽堿地大面積種植，因此，發掘參與其鹽逆境響應中耐鹽功能基因，并分析其耐鹽分子機制，有助于利用基因工程技術培育適合南方鹽堿地種植的紫花苜蓿新品種。

目前已經鑒定出部分苜蓿耐鹽基因，Miller等[1]克隆出紫花苜蓿MsPDH和MsP5CDH兩個脯氨酸脫氫酶基因，該基因具有增加游離脯氨酸積累功能；Luo等[2]利用RT-PCR方法從紫花苜蓿中分離得到受脅迫誘導表達的解旋酶基因MH1，該基因可提高活性氧(ROS)的清除和提高植物滲透調節能力；Long等[3]從紫花苜蓿中鹽脅迫誘導中篩選出富含甘氨酸蛋白基因(MsGRP)，該基因具有抑制種子萌發和擬南芥(Arabidopsisthaliana)幼苗生長的功能；Ma等[4]從紫花苜蓿鹽脅迫中成功克隆一個MsGME基因，該基因對抗壞血酸合成起著重要的作用。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)作為豆科模式植物，與苜蓿親緣關系很近，與四倍體苜蓿基因組具有很高的同源性。Zahaf等[5]對豆科模式植物蒺藜苜蓿鹽脅迫下全基因組分析，為開展紫花苜蓿耐鹽分子機制研究提供了重要信息，但紫花苜蓿為同源四倍體，異花授粉植物，其基因組非常復雜，仍然難以揭示紫花苜蓿耐鹽的分子機理。

轉錄因子作為調控下游基因表達的重要元件，調節著各種生理活動的關鍵環節，一些調節逆境應答的轉錄因子基因是改良植物耐鹽性的重要靶標基因，因此，對逆境應答轉錄因子的研究是現代植物分子生物學研究的熱點。目前采用高通量技術從轉錄組水平上鑒定和分析紫花苜蓿轉錄因子鹽脅迫應答研究還鮮見報道。本研究利用RNA-Seq技術對鹽脅迫處理前后的南方型紫花苜蓿幼苗葉片進行轉錄組測序，鑒定葉片響應鹽脅迫應答轉錄因子及表達特性，以期更好地理解南方型紫花苜蓿對鹽脅迫響應的分子機制，為進一步鑒定和克隆其重要的耐鹽基因，提高南方型紫花苜蓿耐鹽性狀奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料及處理

選擇耐鹽性相對較強的高秋休眠級南方型紫花苜蓿‘Millennium’為材料[6]，將種子先用75%酒精消毒10 min，然后用滅菌水清洗3次，滅菌水中浸泡2 h于20 ℃生長箱內發芽。7 d后，挑選生長一致小苗轉移至塑料盆，盆內裝滿細沙和珍珠巖(體積比3∶1)，每天澆霍格蘭營養液。30 d后加入250 mmol·L-1NaCl至營養液中作為鹽脅迫處理，選取脅迫處理0和72 h的紫花苜蓿地上部葉片組織混合于液氮中保存備用。

1.2RNA的提取及檢測

利用TRNzol Reagent試劑盒分別提取處理與對照組幼葉片RNA，提取過程按試劑盒說明進行。所提取的RNA經電泳檢測合格后送至深圳華大基因科技有限公司進一步確認質量后，將同一樣本所提取的幼葉RNA進行高通量測序。

1.3Illumina 測序

將鹽處理組與對照組總RNA由華大基因科技有限公司完成文庫構建與測序，將構建好的文庫進行其質量和產量檢測。對質量檢測合格后的文庫采用IlluminaHiSeqTM2000進行測序。將經Base calling測序產生的原始圖像轉化為序列數據(Raw data)，繼而轉換為Clean data。采用短reads比對軟件SOAPaligner/SOAP2將Clean reads分別與參考基因組蒺藜苜蓿進行比對。

1.4差異基因的選擇

測序后使用RPKM法計算基因表達量，根據基因表達量(RPKM值)計算其在處理與對照中的差異表達倍數。差異表達倍數大于2倍以上(含2倍)的基因認定為差異表達基因。

1.5熒光定量RT-PCR

以分別提取的處理組與對照組葉片RNA為材料，采用TaKaRa公司的PrimeScript RTreagent Kit With cDNA Eraser試劑盒反轉錄合成cDNA，作為實時熒光PCR反應的模板。根據測序的基因表達譜結果隨機挑取選出4個鹽脅迫轉錄因子基因，Primer Premier 5.0軟件設計熒光定量PCR引物(表1)。利用Primer 5.0 軟件設計qRT-PCR引物，以苜蓿GAPDH(GenBank登錄號為MTR_4g131180)為內參，引物為5′-GTGGTGC-CAAGAAGGTTGTTAT-3′和5′-CTGGGAATGATGTTGAAGGAAG-3′。各處理均做3次重復計算基因的相對表達量。

表1驗證DEG數據準確性的qRT-PCR引物

Table 1The primers to detect the accuracy of DEG data by qRT-PCR

基因編號正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')cds8203CAGCAATCTGTCT-GAATGAAAGACGGTTAGTTCCAG-CACCGcds4945TATGGAA-CAGGGTCGCATTGAGTCCGTATGCAAT-GGGTTCAcds25725TACGTCCGAATCAAG-GAGACCTAAGTAATTCCTCAAC-CTCGcds27088ATTTGTGCCACCACG-GATCATCCGTGATGCGTGTC-CATAG

2　結果與分析

2.1測序質量分析

對測得的reads分析表明：對照樣本(WT_CK2)和鹽脅迫處理樣本(WT_N2) raw reads在去除接頭序列、低質量的序列等后，得到高質量的reads。由于遺傳背景的差異和注釋信息量的限制，對照樣本clean reads中近52.47%可被參考基因組注釋，47.53%的clean reads未能注釋到對應的基因(表2)，鹽脅迫處理樣本(WT_N1)樣本的reads注釋情況相近。此外， 測序隨機性分析表明：reads在基因中的分布均一，說明測序樣品的mRNA完整性和片段化均一性很好，序列分析中沒有mRNA降解和偏向性的影響。

表2DEG樣品測序數據統計結果

Table 2Statistics of sequencing data of the DEG samples

reads概括對照(WT_CK2)測序數量比例/%處理(WT_N2)測序數量比例/%總堿基對數5649393600100.005435528040100.00reads的凈序列數62771040100.0060394756100.00匹配上基因組的總reads數3293381052.473204857853.07完全匹配序列數53081048.4645402727.52錯配數小于并等于2的reads數2762570644.012750830645.55特異匹配的序列數2286443036.432101272034.79多位點匹配序列數1006938016.041103585818.27未匹配的總reads序列數2983722847.532834617646.93

2.2紫花苜蓿葉片鹽脅迫應答轉錄因子基因分析

將鹽處理組與對照組總RNA由華大基因科技有限公司完成文庫構建與測序，以差異檢驗FDR值≤0.001且差異倍數不低于2倍為差異表達基因的選擇標準，紫花苜蓿葉片在250 mmol·L-1NaCl脅迫下72 h時，共檢測到31 372個基因表達量發生了改變，對照樣本(WT_CK2)和鹽脅迫處理樣本(WT_N2)有7 497個基因表現為差異表達，其中4 078個DEGs在鹽脅迫響應中表達上調，3 419個DEGs表達下調。南方型紫花苜蓿葉片鹽響應下共有隸屬于46個轉錄因子家族474個轉錄因子差異表達，占總差異表達基因的6.32%，其中242個上調、232個下調(圖1)。

圖1　正常和鹽脅迫下紫花苜蓿葉片轉錄因子基因數目Fig.1　Distribution of differentially expressed genes and transcription factor number in the leaves of alfalfa under control and salt stress

圖2可以看出：轉錄因子基因表達差異不一，Log2ratio基因表達量變化15倍以內，占差異表達轉錄因子基因總數的99.64%。其中，表達量上、下調1～2倍的基因分別占差異表達上、下調基因總數的42.56%和57.326%，表達量上、下調2～5倍的基因分別占37.60%和30.60%，表達量上、下調5～10倍的基因分別占5.37%和2.16%，表達量上、下調10～15倍以上的基因分別占14.05%和9.91%，表達量上調15倍以上的基因占0.41%。相比而言，上調基因的表達量增強幅度更大。

圖2　紫花苜蓿葉片響應鹽脅迫轉錄因子差異基因倍數變化Fig.2　Fold change of differentially expressed genes of transcription factor in the leaves of alfalfa under control and salt stress

圖3可以看出：紫花苜蓿葉片響應鹽脅迫下有46個轉錄因子家族的差異表達。其中差異表達顯著且包含轉錄因子家族數量較多的家族有MYB上調表達的轉錄因子最多為51個，且下調表達轉錄因子也最多為39個。E2F-DP，FAR1，GeBP和PLATZ轉錄因子家族基因全部上調，BES1，C2C2-GATA，RWP-RK，S1Fa-like，SBP，Sigma70-lik，SRS和TUB轉錄因子家族基因全部下調。其他的轉錄因子家族基因如AP2-EREBP，bHLH，NAC，MADS，Trihelix和WRKY等轉錄家族成員基因既有轉錄水平上調的，也有轉錄水平下調的，暗示著轉錄家族在鹽響應中調控方式的復雜性。

2.3紫花苜蓿葉片鹽脅迫應答重要轉錄因子基因分析

轉錄因子激活或抑制逆境脅迫相關基因的表達。目前研究已證實bZIP，WRKY，AP2，NAC，bHLH，DERB，MYB和C2H2等家族基因呈現在鹽脅迫應答中起著重要作用。根據BLASTP 結果對表達DEGs 進行功能注釋(表3)，發現許多鹽逆境相關的轉錄因子基因顯著上調或下調表達，上調如乙烯響應因子MsERF110(gi|357443595和gi|357464465)、MsDREB(gi|357444089)和MsERF071(gi|357438137)、bHLH轉錄因子MsbHLH36(gi|357474369)、鋅指轉錄因子MsZFP(gi|357510471和gi|357503025)、MYB轉錄因子(gi|657379544，gi|657378081和gi|357476493)、NAC轉錄因子MsNAC(gi|657404698，gi|657387760和gi|657373824)、GRAS轉錄因子MsGRAS(gi|357472773和gi|657400127)、Trihelix轉錄因子MsMGT-3a(gi|657378410)和WRKY轉錄因子MsWRKY(gi|657389642，gi|357512541，gi|657393579，gi|357437277，gi|657390965和gi|657375305)等。下調如Alfin-like轉錄因子MsAlfin-like(gi|657396279)、bZIP轉錄因子MsbZIP48(gi|657376782)、GRAS轉錄因子MsGRAS(gi|357488941和gi|657390120)、MYB轉錄因子MsMYB(gi|657404680，gi|657400077和gi|657370137)。

圖3　紫花苜蓿葉片響應鹽鹽脅迫轉錄因子家族分布Fig.3　Distribution of transcription factor family in the leaf of alfalfa under control and salt stress

表3紫花苜蓿葉片響應鹽脅迫誘導表達重要轉錄因子

Table 3Salt-stress induced key transcription factors in the leaf of alfalfa

基因名稱基因編號NCBI登錄號log2值基因注釋MsAlfin-likecds22057gi|657396279-14.93Fingerandbromo-adjacent-likedomainproteinMsERF110cds6246gi|3574435955.79Ethylene-responsivetranscriptionfactorERF110MsDREBcds6506gi|3574440896.54Dehydration-responsiveelementbindingpro-teinMsERF110cds20178gi|35746446510.99Ethylene-responsivetranscriptionfactorERF110MsAP2cds27796gi|65738981611.11AP2domaintranscriptionfactorMsERF071cds1138gi|35743813711.72Ethylene-responsivetranscriptionfactorERF071MsAP2ERFcds46090gi|657379212-5.42AP2-likeethylene-responsivetranscriptionfac-torMsbHLH36cds26354gi|35747436912.95TranscriptionfactorbHLH36MsbHLH123cds12507gi|357452535-11.66TranscriptionfactorbHLH123MsTT8cds4309gi|357440757-9.86TranscriptionfactorTT8MsZFPcds46755gi|3575104714.62ZincfingerproteinMsZFPcds42302gi|35750302511.52ZincfingerproteinMsGRAScds25313gi|3574727734.68GRASfamilytranscriptionfactorMsGRAScds13659gi|6574001274.08GRASfamilytranscriptionfactorMsGRAScds34174gi|357488941-12.35GRASfamilytranscriptionfactorMsGRAScds28255gi|657390120-5.30GRASfamilytranscriptionfactorMsHSFB-3cds46084gi|35750969511.88HeatstresstranscriptionfactorB-3MsHSFB-4cds36262gi|357493861-10.97HeatstresstranscriptionfactorB-4MsMYBcds46539gi|6573795445.31MybtranscriptionfactorMsMYBcds43910gi|65737808112.61MybtranscriptionfactorMsNADcds52762gi|357518277-13.18Nucleicacidbindingtranscriptionfactoractivi-tyMsMYBcds5693gi|657404680-12.32MYBtranscriptionfactorMsMYBcds13584gi|657400077-12.10MYBtranscriptionfactorMsMYBcds56360gi|657370137-10.92Myb-likeDNA-bindingdomain,classproteinMsNACcds5707gi|65740469810.70NACtranscriptionfactor-likeproteinMsNACcds24642gi|65738776014.10NACtranscriptionfactor-likeproteinMsNACcds51130gi|6573738245.30NACtranscriptionfactor-likeproteinMsMGT-3acds44315gi|6573784103.88TrihelixtranscriptionfactorGT-3a,putativeMsWRKYcds27606gi|65738964210.34WRKYfamilytranscriptionfactorMsWRKYcds48163gi|35751254110.94WRKYtranscriptionfactorMsWRKYcds17525gi|65739357911.59WRKYtranscriptionfactorMsWRKYcds544gi|35743727713.30WRKYtranscriptionfactorMsWRKYcds53281gi|65737530512.38WRKYfamilytranscriptionfactorMsWRKYcds29546gi|6573909655.30WRKYfamilytranscriptionfactorMsWRKYcds42591gi|6573770355.22WRKYfamilytranscriptionfactorMsWRKYcds36449gi|3574942695.08WRKYfamilytranscriptionfactor

2.4差異表達基因的qRT-PCR熒光定量驗證

為了驗證數字基因表達譜數據的可靠性，隨機篩選4個差異表達基因，其中2個基因上調cds8203和cds4945，2個下調基因cds25725和cds27088，以苜蓿GAPDH(GenBank登錄號為MTR_4g131180)為內參，進行qRT-PCR驗證。結果表明，4個基因在鹽脅迫處理后發生不同程度的表達(圖4)，但脅迫誘導表達的變化趨勢相同，說明基因表達譜的分析結果可靠。

qRT-PCR 中的誤差線表示平均值的標準差(n=3)。圖4　DEGs 的qRT-PCR 驗證Fig.4　Validation of DEGS data by qRT-PCR

3　討論

轉錄因子在逆境脅迫下可以來激活或抑制下游基因的轉錄表達，在植物對逆境脅迫應答中充當著重要角色。目前已發現MYB，NAC，bHLH，DERB，C2H2，HD-Zip/b-ZIP和WRKY等鹽脅迫相關的轉錄因子。本研究發現，紫花苜蓿葉片在250 mmol·L-1NaCl脅迫下72 h時，表達量差異達到2倍以上的基因共7 497個，其中包含46個轉錄家族474個轉錄因子，242個上調、232個下調，這也暗示著紫花苜蓿葉片鹽脅迫應答各類轉錄因子調控方式的復雜性。

AP2/EREBP家族轉錄因子在植物中極其廣泛，參與多種生理生化反應的信號誘導相關。目前已經證實AP2/EREBP家族中DREB類和ERF類轉錄因子在逆境抗性中起重要作用。如過表達TSRF1可提高水稻(Oryzasativa)對滲透和干旱脅迫的耐受性[7]。過表達AhDREB1可提高煙草(Nicotianatabacum)耐高鹽脅迫能力[8]。但也有報道，ERFs類轉錄因子在植物逆境調控起負作用，如過表達SlERF3可降低番茄(Lycopersiconesculentum)對鹽的耐受性[9]。本研究發現39個AP2/EREBP基因參與紫花苜蓿葉片相應鹽脅迫應答過程，其中23個上調，16個下調。在鹽脅迫下，AP2/EREBP基因表現上調和下調現象，說明不同的基因參與鹽脅迫應答調控方式并不相同。

NAC是植物特有的轉錄因子基因家族，已有研究表明，NAC轉錄因子在植物發育、逆境應答、衰老和次生壁合成等眾多的生物學過程中發揮著重要作用[10-11]。大量研究表明：NAC家族轉錄因子存在正負兩種調控機制，過表達AtNAC2的轉基因降低擬南芥的耐鹽性[12]，過表達ONAC045可提高水稻轉基因植株抗旱和耐鹽性[13]。本研究也發現：56個受鹽脅迫誘導NAC家族轉錄因子，40個上調，16個下調，其中gi|657404698和gi|657387760上調10倍以上，這可能在紫花苜蓿葉片對鹽脅迫應答反應中起重要的作用。

MYB轉錄因子是植物最大的轉錄因子家族之一，在植物非生物脅迫應答中具有重要作用。研究表明：超量表達JAmyb可增加水稻轉基因植株的耐鹽性[14]，過表達MdSIMYB1可增強蘋果和煙草對高鹽、干旱和冷脅迫的耐受性[15]。在本研究中，我們也發現90個MYB轉錄家族成員中50%以上成員上調明顯，推測它在紫花苜蓿響應鹽脅迫過程中可能發揮著重要作用。紫花苜蓿葉片鹽響應下WRKY家族轉錄因子中33個得到表達，其中29個WRKY基因表達上調、4個下調。WRKY基因家族各成員參與調控植物的抗逆反應及其信號轉導途徑的建立，在植物的生長發育和耐逆抗病過程中都發揮著極其重要的調控作用。現已證實WRKY家族轉錄因子存在正負兩種調控機制，過表達擬南芥中的AtWRKY25和AtWRKY33能夠提高植物對高鹽的耐性[16]，過表達棉花GhWRKY39-1能夠提高轉基因煙草對鹽的耐受性[17]，但過表達OsWRKY45-1可降低水稻對高鹽的耐受性[18]。因此，WRKY基因參與鹽脅迫具有復雜性，可能在紫花苜蓿鹽脅迫應答中起重要作用。

bZIP轉錄因子家庭在植物防衛反應和逆境脅迫應答過程中起著十分重要的作用。據報道bZIP家族轉錄因子在植物逆境脅迫應答過程存在著正負兩種調控機制，如OsbZIP12，OsbZIP46和OsbZIP71在ABA介導的干旱和鹽耐受性扮演著一個重要的角色[19]，但GmbZIP44，GmbZIP62和GmbZIP78作為負調控因子參與大豆的鹽脅迫響應[20]。本研究發現5個bZIP轉錄因子被調控，其中3個上調和2個下調。

C2H2型鋅指蛋白基因是植物中最重要的轉錄調節子家族之一，已在擬南芥和水稻基因組中分別發現C2H2型家族的基因成員有176個和189個。C2H2型轉錄家族因子參與植物生長發育和脅迫應答的多種細胞生化過程。如ZFP182編碼一個具有轉錄激活特性的鋅指蛋白，過表達ZFP182能夠提高轉基因煙草和水稻的耐鹽水平[21]。過表達ZFP245和ZFP179可以使植物抗氧化能力顯著增強，活性氧ROS清除能力提高，植物體內對鹽脅迫應答中發揮重要作用[22-23]。本研究發現5個C2H2轉錄因子被調控，其中4個上調和l個下調，其中gi|357503025上調11倍以上。

bHLH轉錄因子家庭是植物中僅次于MYB轉錄因子的第二大轉錄因子超家族。擬南芥和水稻中發現有162和167個bHLH轉錄家族成員。bHLH轉錄因子能與E-box順式作用元件特異性結合，調控脅迫應答相關基因的表達。過表達bHLH122和OrbHLH001分別可增加擬南芥和水稻的耐鹽性[24-25]，共表達AtWRKY28和AtbHLH17能顯著提高植物對多種非生物逆境脅迫的耐受性[26]。本研究發現32個bHLH轉錄因子參與紫花苜蓿葉片響應鹽脅迫應答過程，8個上調，24個下調，其中gi|357474369上調12倍以上，推測這些bHLH轉錄因子可能在紫花苜蓿鹽脅迫應答過程中起重要調控作用。

Trihelix轉錄因子家族是一類最近才被引發關注的基因家族，擬南芥和水稻中發現有30個和31個Trihelix轉錄家族成員。研究顯示Trihelix轉錄因子在非生物逆境應答中發揮重要作用[27-28]。本研究中也發現6個Trihelix轉錄因子差異表達。熱激轉錄因子HSF是一類已知的有抗熱功能的基因，可調節熱擊基因的表達，在植物對環境脅迫的分子響應中發揮重要作用。Friedberg等[29]首次克隆出MsHSFA4基因，其表達受熱和冷脅迫誘導。過表達胡楊(Populuseuphratica)PeHSF可增強轉基因煙草幼苗耐鹽性[30]。本研究檢測到3個HSF轉錄因子上調表達，推測HSF家族的轉錄因子在鹽脅迫應答中發揮著一定的作用。

本研究利用RNA-Seq鑒定出474個轉錄因子參與南方型紫花苜蓿葉片鹽脅迫應答過程。轉錄因子基因是改良植物耐鹽性的重要靶標基因，但目前只有少數幾個紫花苜蓿耐鹽轉錄基因被克隆，因此，挖掘并克隆轉錄因子耐鹽關鍵優異基因，并明確其控制下游靶基因及其在信號傳導通路中作用機制還需要進一步深入的研究。

[1]MILLER G， STEIN H， HONIG A. Responsive modes ofMedicagosativaproline dehydrogenase genes during salt stress and recovery dictate free proline accumulation [J].Planta， 2005，222(1):70-79.

[2]LUO Y， LIU Y B， DONG Y X， et al. Expression of a putative alfalfa helicase increases tolerance to abiotic stress inArabidopsisby enhancing the capacities for ROS scavenging and osmotic adjustment [J].JournalofPlantPhysiology， 2009，166(4): 385-394.

[3]LONG R C， YANG Q C， KANG J M， et al. Overexpression of a novel salt stress-induced glycine-rich protein gene from alfalfa causes salt and ABA sensitivity inArabidopsis[J].PlantCellReports， 2013，32(8): 1289-1298.

[4]MA L C， WANG Y， LIU W， et al. Overexpression of an alfalfa GDP-mannose 3， 5-epimerase gene enhances acid， drought and salt tolerance in transgenicArabidopsisby increasing ascorbate accumulation [J].BiotechnologyLetters， 2014，36(11): 2331-2341.

[5]ZAHAF O， BLANCHET S， ZELICOURT A， et al .Comparative transcriptomic analysis of salt adaptation in roots of contrastingMedicagotruncatulagenotypes [J].MolecularPlant， 2012，5(5):1-14.

[6]馬進， 鄭鋼，蔡建國. 南方型紫花苜蓿基因型在組織培養條件下對NaCl的耐性[J]. 浙江農業學報， 2011， 23(4):782-786.

[7]QUAN R D, HU S J, ZHANG Z L, et al. Overexpression of an ERF transcription factor TSRF1 improves rice drought tolerance[J].PlantBiotechnologyJournal， 2010， 8(4): 476-488.

[8]SHEN Y G， ZHANG W K， YAN D Q， et al. Characterization of a DRE-binding transcription factor from a halophyteAtriPlexhortensis[J].TheoreticalandAppliedGeneitics, 2003, 107(1): 155-161.

[9]PAN I C， LI C W， SU R C，et al. Ectopic expression of an EAR motif deletion mutant of SlERF3 enhances tolerance to salt stress andRalstoniasolanacearumin tomato [J].Planta， 2010， 232(5):1075-1086.

[10]PURANIK S， SAHU P P， SRIVASTAVA P S，et al. NAC proteins: regulation and role in stress tolerance [J].TrendsinPlantScience， 2012， 17 (6):369-381.

[11]NAKASHIMA K， TAKASAKI H， MIZOI J， et al. NAC transcription factors in plant abiotic stress responses [J].BiochimicaetBiophysicaActa， 2012， 1819 (2): 97-103.

[12]BALAZADEH S， SIDDIQUI H， ALLU A D， et al. A gene regulatory network controlled by the NAC transcription factor ANAC092/AtNAC2/ORE1 during salt-promoted senescence [J].ThePlantJournal， 2010， 62(2): 250-264.

[13]SONG S Y， CHEN Y， CHEN J， et al. Physiological mechanisms underlyingOsNAC5-dependent tolerance of rice plants to abiotic stress [J].Planta, 2011, 234(2): 331-345.

[14]YOKOTANI N, ICHIKAWA T, KONDOU Y, et al.Role of the rice transcription factorJAmybin abiotic stress response [J].JournalofPlantResearch， 2013， 126(1): 131-139.

[15]WANG R K， CAO Z H， HAO Y J. Overexpression of a R2R3 MYB geneMdSIMYB1 increases tolerance to multiple stresses in transgenic tobacco and apples [J].PhysiologiaPlantarum， 2014， 150(1): 76-87.

[16]JIANG Y Q， DEYHOLOS M K. Functional characterization of Arabidopsis NaCl-inducible WRKY25 and WRKY33 transcription factors in abiotic stresses [J].PlantMolecularBiology， 2009， 69(1-2): 91-105.

[17]SHI W， HAO L， LI J， et al. TheGossypiumhirsutumWRKY geneGhWRKY39-1 promotes pathogen infection defense responses and mediates salt stress tolerance in transgenicNicotianabenthamiana[J].PlantCellReports， 2014， 33(3): 483-498.

[18]TAO Z, KOU Y J, LIU H B, et al.OsWRKY45 alleles play different roles in abscisic acid signalling and salt stress tolerance but similar roles in drought and cold tolerance in rice [J].JournalofExperimentalBotany， 2011， 62(14): 4863-4874.

[19]LIU C T, MAO B G, OU S J, et al.OsbZIP71， a bZIP transcription factor， confers salinity and drought tolerance in rice [J].PlantMolecularBiology， 2014， 84(1-2): 19-36.

[20]LIAO Y， ZOU HF ， WANG H W， et al. SoybeanGmMYB76，GmMYB92 andGmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenicArabidopsisplants [J].CellResearch，2008， 18(10): 1047-1060.

[21]HUANG J， YANG X， WANG M M， et al. A novel rice C2H2-type zinc finger protein lacking DLN-box/EAR-motif plays a role in salt tolerance [J].BiochimicaetBiophysicaActa， 2007， 1769(4): 220-227.

[22]HUANG J， SUN S J， XU D Q， et al. Increased tolerance of rice to cold， drought and oxidative stresses mediated by the overexpression of a gene that encodes the zinc finger protein ZFP245[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications, 2009，389(3): 556-561.

[23]SUN S J， GUO S Q， YANG X， et al. Functional analysis of a novel Cys2/His2-type zinc finger protein involved in salt tolerance in rice [J].JournalofExperimentalBotany, 2010, 61(10): 2807-2818.

[24]LIU W， TAI H， LI S， et al. bHLH122 is important for drought and osmotic stress resistance inArabidopsisand in the repression of ABA catabolism [J].NewPhytologist， 2014，201(4): 1192-204.

[25]LI F， GUO S， ZHAO Y， et al. Overexpression of a homopeptide repeat-containing bHLH protein gene (OrbHLH001) from Dongxiang Wild Rice confers freezing and salt tolerance in transgenicArabidopsis[J].PlantCellReports，2010， 29(9): 977-86.

[26]BABITHA KC， RAMU SV， PRUTHVI V， et al. Co-expression ofAtbHLH17 andAtWRKY28 confers resistance to abiotic stress inArabidopsis[J].TransgenicResearch，2013， 22 (2): 327-341.

[27]FANG Y J， XIE K B， HOU X， et al. Systematic analysis of GT factor family of rice reveals a novel subfamily involved in stress responses [J].MolecularGeneticsGenomics， 2010， 283(2): 157-169.

[28]WANG X H， LI Q T， CHEN H W， et al. Trihelix transcription factor GT-4 mediates salt tolerance via interaction with TEM2 inArabidopsis[J].BMCPlantBiology， 2014， 14∶339-345.

[29]FRIEDBERG J N， BOWLEY S R， MCKERSIE B D. Isolation and characterization of class A4 heat shock transcription factor from alfalfa [J].PlantScience，2006， 171(3)：332-344.

[30]SHEN Z D， DING M Q， SUN J， et al. Overexpression ofPeHSFmediates leaf ROS homeostasis in transgenic tobacco lines grown under salt stress conditions [J].PlantCell，TissueandOrganCulture，2013，115(3):299-308.

(責任編輯張韻)

Identification and analysis of salt stress-responsive transcription factor in leaf of southern type alfalfa

PEI Cui-ming， ZHANG Zhen-ya， MA Jin*

(SchoolofLandscapeArchitecture，ZhejiangAofFUniversity，Lin’an311300，China)

Illumina RNA-sequencing was performed in two alfalfa samples of control (WT_CK2) and NaCl-treated samples(WT_N2)in order to estimate a broad spectrum of transcription factor genes affected by salt stress，and the real-time fluorescent qRT-PCR technique was used to verify the expression characteristics of random selected 4 genes. These results indicated that 7 497 of them showed two fold higher or lower difference under NaCl stress from the control， including 474 transcription factors (TFs) belonging to 46 transcription family， among which 242 genes were up-regulated and 232 were down-regulated. Transcription factor families including bHLH，NAC，WRKY and C2H2， among which more than 70% genes were up-regulated. Expression patterns of random selected 4 genes confirmed the results of the digital gene expression profile. In addition， this study also identified a large number of candidate functional transcription factor genes such asMsERF110，MsERF071，MsbHLH36，MsZFP，MsHSFB-3，MsMYB，MsNAC，MsWRKYand so on， which appeared to be constitutively involved in the response to salt stress. This study revealed that many transcription factor family were involved in response to salt stress in leaf of southern type alfalfa.

southern type alfalfa; transcription factor; leaf transcriptome; salt stress

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.02

2015-09-18

國家自然科學基金資助項目(31272494)

裴翠明 (1991—)，女，河南商丘人，碩士研究生，研究方向為園林植物研究和應用。E-mail: 1158862079@qq.com

，馬進，E-mail: majinzjl@163.com

S542

A

1004-1524(2016)04-0550-08

裴翠明，張振亞，馬進. 南方型紫花苜蓿葉片鹽脅迫應答轉錄因子鑒定與分析[J].浙江農業學報，2016，28(4)： 550-557.