小麥優(yōu)質(zhì)亞基和抗白粉病Pm4a基因聚合體的PCR鑒定

劉永安， 潘彬榮， 岳高紅， 梅喜雪， 許立奎，*， 張宗宸， 周志輝

(1.浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 溫州 325006； 2.溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 作物研究所，浙江 溫州 325006)

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小麥優(yōu)質(zhì)亞基和抗白粉病Pm4a基因聚合體的PCR鑒定

劉永安1，2， 潘彬榮1，2， 岳高紅1，2， 梅喜雪2， 許立奎1，2，*， 張宗宸1，2， 周志輝1，2

(1.浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 溫州 325006； 2.溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 作物研究所，浙江 溫州 325006)

為選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病的小麥品系(種)，以含1Dx5+1Dy10亞基的寧春4號(hào)和含Pm4a抗白粉病基因的揚(yáng)麥19為親本，從其雜交F2后代 1/3～1/2粒種子提取DNA，并利用1Dx5亞基和Pm4a基因的特異標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果表明：在100粒F2代種子中，有51粒種子被鑒定為1Dx5亞基和Pm4a基因聚合體。該試驗(yàn)采用的PCR鑒定，克服了SDS-PAGE電泳耗時(shí)多、容易對(duì)遷移率相近亞基做出誤判的缺點(diǎn)，同時(shí)也擺脫了白粉病大田和溫室鑒定時(shí)受氣候條件和農(nóng)時(shí)的限制，大大提高了鑒定的效率和準(zhǔn)確性。對(duì)中選的聚合體做進(jìn)一步鑒定，有望選出農(nóng)藝性狀好、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、抗白粉病的小麥品系。

小麥；高分子量谷蛋白亞基；白粉病；聚合體；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

小麥的蛋白質(zhì)含量通常為10%～15%[1]，主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組成[2]。其中，醇溶蛋白和谷蛋白為小麥種子的主要儲(chǔ)藏蛋白，醇溶蛋白賦予小麥面團(tuán)的延展性，而谷蛋白賦予小麥面團(tuán)的彈性，二者的共同作用是使小麥面團(tuán)具有與水稻、玉米等谷物顯著不同的加工品質(zhì)，即具有延彈性[3-4]。根據(jù)分子量的大小，小麥谷蛋白又可分為高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)。在六倍體小麥中，HMW-GS由分別位于1A，1B和1D染色體長臂上的Glu-1A，Glu-1B 和 Glu-1D位點(diǎn)編碼，每一位點(diǎn)由編碼分子量較大的x亞基基因和分子量較小的y亞基基因構(gòu)成[3-4]。盡管HMW-GS含量只占小麥籽粒蛋白質(zhì)總含量的12%左右[4]，但其對(duì)面包、饅頭、面條等食品的加工品質(zhì)影響很大，其中對(duì)面包加工品質(zhì)的貢獻(xiàn)率高達(dá)70%左右[3]。因?yàn)镠MW-GS為儲(chǔ)藏蛋白，編碼HMW-GS的基因發(fā)生突變對(duì)小麥的萌發(fā)影響不大，所以HMW-GS具有豐富的多態(tài)性。研究表明，不同的HMW-GS對(duì)面團(tuán)加工品質(zhì)的影響也明顯不同。在目前已知的HMW-GS中，緊密連鎖的1Dx5+1Dy10亞基為公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)亞基，含有1Dx5+1Dy10亞基基因的小麥品種，其食品加工品質(zhì)也往往較優(yōu)。因此，篩選含有1Dx5+1Dy10亞基基因的植株是小麥品種改良的重要手段之一。

小麥白粉病是由Blumeriagraminisf. sp.Tritici引起的一種真菌病害，通常情況下可使小麥減產(chǎn)5%～34%[5-6]，重者甚至絕收。在水肥條件好、偏施氮肥、種植密度大的田塊，由于通風(fēng)透光條件較差，濕度大，真菌孢子很容易萌發(fā)，造成白粉病的發(fā)生。目前，防治小麥白粉病的措施主要有種植抗病品種、改善栽培條件、清除自生苗以及藥劑防治[7-8]。其中，種植抗病品種是最為經(jīng)濟(jì)有效的手段。然而，隨著生理小種的變化，一些抗病品種對(duì)白粉病逐漸喪失了抗性。研究表明，Pm2，Pm4a，Pm4b，Pm12，Pm13，Pm16，Pm18～Pm21，Pm5+6等基因仍具有較強(qiáng)的抗性[9]，可作為白粉病抗性基因加以利用。

小麥為浙江省重要的旱糧作物，發(fā)展小麥生產(chǎn)對(duì)充分利用冬閑田、穩(wěn)定糧食生產(chǎn)面積和產(chǎn)量、保障糧食安全有著重要意義。然而，浙江省屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，溫暖濕潤，潮濕多雨，光照相對(duì)不足。一方面在小麥生長期間，特別是中后期容易發(fā)生白粉病等病害，致使小麥千粒重降低，產(chǎn)量下降；另一方面籽粒蛋白質(zhì)的積累也受到影響，食品加工品質(zhì)普遍較差，如用這種面粉制成的面條容易斷條、饅頭沒有嚼勁，這些不利因素嚴(yán)重制約了種植小麥的經(jīng)濟(jì)效益，降低農(nóng)民的種糧積極性。因此，將優(yōu)質(zhì)亞基基因、抗白粉病抗性基因?qū)氲秸憬≈髟云贩N中去，對(duì)提高浙江省小麥品質(zhì)和抗性有著重要的意義。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用的試驗(yàn)材料為寧春4號(hào)、揚(yáng)麥19、二者雜交F2代分離群體以及中國春(CS)(作對(duì)照)。其中，寧春4號(hào)含有1Ax1，1Bx17+1By18和1Dx5+1Dy10優(yōu)質(zhì)亞基基因，該品種綜合性狀好，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，感白粉病，但具有耐病性，在我國西北春麥區(qū)推廣30多年而不衰，是一個(gè)優(yōu)異的種質(zhì)資源[10]，在本研究中用作父本；揚(yáng)麥19含有Pm4a抗白粉病基因，分蘗力較強(qiáng)，成穗率較高，為我國長江中下游冬小麥區(qū)的主推品種[11]，在本研究中用作母本。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA的提取

參照劉永安等[12]的無氯仿提取小麥半籽粒DNA的方法，只是在研磨過程中改用高通量組織研磨儀研磨樣品。

1.2.21Dx5+1Dy10優(yōu)質(zhì)亞基和Pm4a基因的PCR鑒定

考慮到1Dx5亞基基因與1Dy10亞基基因緊密連鎖，本研究只對(duì)1Dx5亞基基因進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中含模板DNA 1 μL，10×Buffer(100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.3， 500 mmol·L-1KCl)2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)5 μL，dNTP Mixture(每組分濃度為10 mmol·L-1)2 μL，每種引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.3 μL。反應(yīng)體系中各試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物也由該公司合成，其序列及預(yù)擴(kuò)增片段見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，60 ℃(1Dx5)或56 ℃(Pm4a)退火1 min，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表1引物序列及其預(yù)擴(kuò)增片段

Table 1The primers and target sequences

引物名稱序列(5'-3')擴(kuò)增片段大小/bp基因位點(diǎn)P1P2GCCTAGCAACCTTCACAATCGAAACCTGCTGCGGACAAG-3'[13]450/-1Dx5+/-P3P4GTGGTGTATCAAATGTCATCAGTACTACTCCAGTGACCCCATCTGCTCATAC-3'[14]470/-Pm4a+/-

注：+表示含目的基因；-表示不含目的基因。

1.2.3寧春4號(hào)和揚(yáng)麥19 HMW-GS的SDS-PAGE電泳鑒定

為驗(yàn)證寧春4號(hào)種子含有1Dx5+1Dy10優(yōu)質(zhì)亞基基因的真實(shí)性及PCR鑒定的可靠性，同時(shí)也為了解揚(yáng)麥19 HMW-GS的組成，對(duì)寧春4號(hào)和揚(yáng)麥19進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。HMW-GS的提取參照徐黎黎等[15]的方法，采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12.5%，二者交聯(lián)度均為3.33%，考馬斯亮藍(lán)染色；揚(yáng)麥19亞基組成分析采用Payne等[16]建立的系統(tǒng)。

2　結(jié)果與分析

2.11Dx5和Pm4a基因的PCR鑒定結(jié)果

圖1-A所示：寧春4號(hào)可擴(kuò)增出450 bp條帶，而揚(yáng)麥19未擴(kuò)增出該條帶，說明寧春4號(hào)含有1Dx5亞基基因。圖1-B所示：揚(yáng)麥19可擴(kuò)增出470 bp條帶，而寧春4號(hào)未擴(kuò)增出該條帶，說明揚(yáng)麥19含有Pm4a基因。

2.2寧春4號(hào)和揚(yáng)麥19 HMW-GS的SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果

由圖2所示：寧春4號(hào)的HMW-GS組成為1Ax1，1Bx17+1By18，1Dx5+1Dy10，揚(yáng)麥19的HMW-GS組成為Null，1Bx7+1By9，1Dx2+1Dy12，說明本研究所用的寧春4號(hào)種子確實(shí)含有1Dx5+1Dy10優(yōu)質(zhì)亞基，同時(shí)也說明PCR鑒定1Dx5亞基的結(jié)果是可靠的。不過，從圖2也可發(fā)現(xiàn)，1Dx2與1Dx5亞基的遷移率比較相似，而1Dy10與1Dy12的遷移率則更相近，在用SDS-PAGE電泳鑒定它們時(shí)會(huì)容易造成誤判，尤其是上樣量大的情況下，電泳條帶就會(huì)變寬(如泳道2)，亞基之間的差異就更會(huì)被掩蓋。因此，用SDS-PAGE電泳鑒定小麥種子是否含1Dx5+1Dy10亞基結(jié)果的準(zhǔn)確性不如PCR鑒定，即鑒定1Dx5+1Dy10亞基是否存在時(shí)最好采用PCR進(jìn)行鑒定。

M： Marker；1： 寧春4號(hào)；2： 揚(yáng)麥19。圖1　1Dx5亞基基因(A)和Pm4a基因(B)的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1　Agarose gel electrophoresis of PCR product of 1Dx5 subunits (A) and Pm4a (B)

CS： 中國春；1和2： 寧春4號(hào)；3和4： 揚(yáng)麥19。圖2　寧春4號(hào)和揚(yáng)麥19號(hào)高分子量谷蛋白亞基SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2　SDS-PAGE electrophoresis of HMW-GS of Ningchun 4 and Yangmai 19

2.3寧春4號(hào)和揚(yáng)麥19 F2分離群體PCR檢測(cè)結(jié)果

圖3-A所示：泳道2，4～6，8～11，13，15和18可擴(kuò)增出450 bp條帶，說明這11粒F2代種子含有1Dx5亞基基因，而其他7粒種子不含該基因，但卻是1Dx2亞基的純合體。圖3-B所示：泳道1～3，6～9，11，12，14～18可擴(kuò)增出470 bp條帶，說明這14粒F2代種子含有Pm4a基因，而其他4粒種子不含該基因，但卻是隱性基因純合體。由于圖3-A和圖3-B中編號(hào)相同的泳道檢測(cè)的是同一粒種子，據(jù)此可從圖3中看出，泳道2，6，8，9，11，15和18共7粒種子同時(shí)含有1Dx5亞基基因和Pm4a基因，即為我們所需的聚合體。

M: Marker; 1-18: 部分F2分離群體。圖3　寧春4號(hào)×揚(yáng)麥19部分F2分離群體5亞基(A)和Pm4a基因(B)PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3　Agarose gel electrophoresis of PCR product of 5 subunits (A) and Pm4a gene (B) of some F2 segregation population from Ningchun 4×Yangmai 19

3　討論

SDS-PAGE電泳是鑒定HMW-GS的常用方法，其原理簡(jiǎn)單，易于初學(xué)者掌握，可以從整體上了解樣品的亞基組成。SDS-PAGE電泳比較耗時(shí)，整個(gè)鑒定過程需要灌制分離膠、濃縮膠，樣品HMW-GS的提取，長時(shí)間的電泳、染色和脫色等步驟，這通常要花費(fèi)1～2 d的時(shí)間。同時(shí)，該方法容易對(duì)遷移率相近的不同亞基做出誤判，在上樣量大的情況下，電泳條帶變寬，亞基之間的差異就更容易被掩蓋。在本研究中，如果雜交后代為1Dx5+1Dy10亞基基因和1Dx2+1Dy12亞基基因的雜合體時(shí)，就很難判斷其是雜合體造成的條帶變寬或是由于上樣量大造成的條帶變寬。PCR鑒定是根據(jù)不同HMW-GS序列的差異設(shè)計(jì)特定的引物，對(duì)小麥基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該方法高效快捷，克服了SDS-PAGE電泳的耗時(shí)多、容易誤判遷移率相近亞基等缺點(diǎn)。如本研究用引物P1和P2擴(kuò)增含有1Dx5亞基基因?qū)幋?號(hào)及部分F2后代個(gè)體時(shí)，則會(huì)有450 bp條帶，而擴(kuò)增不含1Dx5亞基基因的揚(yáng)麥19及部分F2后代個(gè)體時(shí)，則沒有450 bp的目標(biāo)條帶，即將SDS-PAGE電泳時(shí)1Dx2亞基與1Dx5亞基相近的遷移率轉(zhuǎn)變?yōu)?50 bp條帶有和無，其鑒定的準(zhǔn)確性大大提高。

雖然1Dx5亞基基因與1Dy10亞基基因緊密連鎖，但在寧春4號(hào)與揚(yáng)麥19雜交F2代群體仍會(huì)有極小的概率出現(xiàn)1Dx5+1Dy12亞基的個(gè)體，僅用1Dx5亞基基因的分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定時(shí)，就有可能將1Dx5+1Dy12亞基的個(gè)體誤判為含1Dx5+1Dy10亞基的個(gè)體。不過，有研究表明，含有1Dx5+1Dy12亞基的小麥品種(系)也具有優(yōu)良的食品加工品質(zhì)[17]。因此，只用1Dx5亞基的分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定就能滿足育種工作的需要。

小麥白粉病抗性鑒定常在溫室、大田進(jìn)行。其中，大田鑒定費(fèi)用較低，但會(huì)受到當(dāng)?shù)貧夂驐l件(溫度、濕度、光照等)的限制，鑒定結(jié)果不穩(wěn)定；溫室鑒定的結(jié)果要好于大田鑒定，但需要投入大量資金安裝控溫、控濕、控光等設(shè)備。本研究從1/3～1/2粒小麥種子中提取DNA，可隨時(shí)對(duì)抗白粉病Pm4a基因進(jìn)行PCR鑒定，其鑒定效率大大提高，而且還擺脫了農(nóng)時(shí)和氣候條件的限制。

本研究對(duì)100粒揚(yáng)麥19×寧春4號(hào)F2代種子進(jìn)行了PCR鑒定，從中篩選出51粒1Dx5亞基基因和Pm4a基因聚合體。然而，本研究所用1Dx5亞基基因和Pm4a基因的分子標(biāo)記只能鑒定其是否存在，而不能區(qū)分所鑒定的籽粒是純合體還是雜合體。根據(jù)孟德爾的自由組合定律推測(cè)，在本研究所篩選出的51粒聚合體中，可能僅有5～6粒為1Dx5亞基基因和Pm4a基因的純合體，而其他45～46粒則為雜合體，其后代會(huì)發(fā)生分離。因此，還需對(duì)這些聚合體品質(zhì)、抗病性以及農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量等作進(jìn)一步鑒定，從中選出農(nóng)藝性狀好、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、兼具白粉病抗性和耐性的小麥品系。

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(責(zé)任編輯張韻)

PCR identification of the wheat polymers with high quality subunit and powdery mildew resistance Pm4a gene

LIU Yong-an1，2，PAN Bin-rong1，2，YUE Gao-hong1，2，MEI Xi-xue2，XU Li-kui1，2，*，ZHANG Zong-chen1，2，ZHOU Zhi-hui1，2

(1.KeyLaboratoryofCropBreedingSouthZhejiang，Wenzhou325006，China; 2.InstituteofCropResearch,WenzhouAcademyofAgriculturalSciences，Wenzhou325006，China)

In order to improve the quality， yield and disease resistance of wheat lines (varieties)， Ningchun 4， and Yangmai 19 which have 1Dx5+1Dy10 subunit andPm4apowdery mildew resistance gene were used as parents in present study， respectively. Genomic DNA was extracted from the 1/3-1/2 grain endosperm of their F2individuals. PCR identification was conducted with the specific markers of 1Dx5 subunit andPm4agenes. The results showed that 51 seeds were identified as 1Dx5 subunit andPm4agene polymers among 100 F2individuals. PCR identification used in present study could overcome the time consuming and being easy to confuse the subunits with similar migration rate of SDS-PAGE electrophoresis， get rid of the restrictions of climate and farming season of field and greenhouse identification， and improve the efficiency and accuracy of identification greatly. With further evaluation of the selected polymers， the lines with good agronomic traits， high yield and quality， resistance to powdery mildew would be hopefully developed.

wheat; high molecular weight glutenin subunit (HMW-GS); powdery mildew; polymer; PCR

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.01

2015-11-05

浙江省旱作糧油科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2011R50026-13)；浙江省重大科技專項(xiàng)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2012C12902-2-3)；溫州市種子種苗科技創(chuàng)新專項(xiàng)(N20120023)；浙江省教育廳一般科研項(xiàng)目(Y201533916)；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(N20140031)

劉永安(1980—)，男，河南太康人，博士，講師，從事小麥、甜糯玉米遺傳育種研究。E-mail: liuanliuan123@163.com

，許立奎，E-mail: lkxu@163.com

S512.1

A

1004-1524(2016)04-0545-05

劉永安， 潘彬榮， 岳高紅，等. 小麥優(yōu)質(zhì)亞基和抗白粉病Pm4a基因聚合體的PCR鑒定[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(4)： 545-549.