野葛塊根異黃酮的提取及抗氧化研究

李　玲，譚　力，全沁果，全　浩，何福林，黃光文，邵金華，閆旭宇，*

(1.湖南科技學院 化學與生物工程學院，湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425199；2.浙江大學 農業與生物技術學院，浙江 杭州 310058；3.中國農業科學院 農產品加工研究所，農業部農產品加工質量安全風險評估實驗室，北京 100193)

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野葛塊根異黃酮的提取及抗氧化研究

李玲1，2，譚力1，全沁果3，全浩1，何福林1，黃光文1，邵金華1，閆旭宇1，*

(1.湖南科技學院 化學與生物工程學院，湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425199；2.浙江大學 農業與生物技術學院，浙江 杭州 310058；3.中國農業科學院 農產品加工研究所，農業部農產品加工質量安全風險評估實驗室，北京 100193)

以土家山區野葛塊根為試驗材料，采用超聲波輔助乙醇提取野葛塊根異黃酮。在單因素試驗的基礎上，以提取率為響應值，運用4因素4水平響應面分析法研究提取過程中工藝參數對提取率的影響，并對異黃酮提取物的抗氧化性能進行了研究。結果表明：最適提取工藝條件為乙醇濃度81.0%，超聲時間41.2 min，提取溫度61.2℃，料液比(m/V)1∶9.5，原料粒徑40目。在此工藝條件下，野葛塊根異黃酮的平均提取率為3.43%。所提取的野葛塊根異黃酮的抗氧化效果低于Vc，但能與其產生一定的協同作用。

野葛；異黃酮；抗氧化

野葛為豆科葛屬多年生落葉草質藤本植物，藥用價值較高，是一種重要的野生植物資源。野葛的適應性很強，廣泛分布在我國除西藏、新疆以外的地區，尤其是湖南地區的溫暖濕潤環境，可促使野葛快速蔓生，是張家界市土家族聚居區的名貴特產之一[1]。研究發現，野葛葛根中異黃酮種類豐富，有葛根素、大豆甙元、金雀花異黃素、大豆甙等30多種異黃酮成分，其中葛根素是葛根的特有成分和主要有效成分，約占野葛總異黃酮含量的50%。葛根異黃酮具有防治和改善心腦血管疾病、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、解酒護肝、調節內分泌系統等多種藥理作用，其藥理活性強，藥效明確，臨床應用廣泛，具有良好的發展前景[2-8]。目前，野葛中異黃酮的提取方法主要有加熱回流法、超聲波輔助提取法、微波輔助萃取法等。與傳統加熱回流和水解相比，超聲提取與微波提取法具有省時節能、提取率高等優點，可降低提取溫度、縮短提取時間，有利于葛根素提取的產業化發展[9-12]。關于野葛異黃酮含量的確定，一般采用葛根素或大豆苷元為標準品。結合實際，本試驗采用超聲波輔助提取法，用土家野生葛根塊根為原料，以乙醇為提取劑來提取野葛塊根異黃酮，以葛根素為標準品，制作標準曲線來測定所提取野葛塊根異黃酮的含量，并研究了野葛塊根異黃酮對DPPH自由基的清除作用，初步探索其抗氧化性能，為綜合開發利用野葛塊根提供一定的數據積累。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1原料與試劑

新鮮野葛塊根，于2014年9月采自湖南張家界山區(土家族聚居區)；葛根素標準品，上海源葉生物科技有限公司；DPPH為分析純，天津市大茂化學試劑廠。

1.1.2儀器與設備

UV-2800型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；KQ5200B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SHIMADZU型分析天平，日本島津公司；WG-71電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；FZ-102植物粉碎機，上海勝啟儀器儀表有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿有限公司；K201D-Ⅱ旋轉蒸發儀，鄭州長城科工貿有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長盛實驗儀器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1提取工藝流程

野葛塊根→切塊→烘干→粉碎→乙醇提取→過濾→提取液。

1.2.2葛根素標準曲線繪制

以葛根素為標準品，將配制好的不同濃度的標準溶液在250 nm下進行比色測定，以吸光度(D)為縱坐標，葛根素質量濃度c(mg·mL-1)為橫坐標，做標準曲線，得葛根素標準曲線回歸方程為D=0.0268c+0.0662，R2=0.999 0。

1.2.3野葛塊根異黃酮提取率的計算

野葛塊根異黃酮的提取率計算公式為：

(1)

式(1)中：W為野葛塊根異黃酮的提取率；D為吸光度值；Q為稀釋的總倍數；V為過濾液總體積(mL)；m為所稱量的試驗材料質量(mg)。

1.3單因素實驗設計

通過單因素實驗，研究乙醇濃度、提取溫度、超聲時間、料液比和原料粒徑對野葛塊根異黃酮提取率的影響，確定超聲輔助提取異黃酮的最適工藝參數范圍。

1.3.1乙醇濃度對野葛塊根異黃酮提取率的影響

準確稱取干燥的野葛塊根粉末2.0 g，分別用40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液浸泡30 min后，在料液比1∶10，溫度50℃，超聲時間20 min條件下，研究乙醇濃度對野葛塊根異黃酮提取率的影響。

1.3.2提取溫度對野葛塊根異黃酮提取率的影響

準確稱取干燥的野葛塊根粉末2.0 g，用最適乙醇濃度溶液浸泡30 min 后，在料液比1∶10，超聲時間20 min的條件下，分別在30，40，50，60，70℃提取，研究提取溫度對野葛塊根異黃酮提取率的影響。

1.3.3超聲時間對野葛塊根異黃酮提取率的影響

準確稱取干燥的野葛塊根粉末2.0 g，用最適乙醇濃度溶液浸泡30 min后，在最適提取溫度，料液比1∶10條件下，分別設定輔助提取時間為10，20，30，40，50 min，研究超聲時間對野葛塊根異黃酮提取率的影響。

1.3.4料液比對野葛塊根異黃酮提取率的影響

準確稱取干燥的野葛塊根粉末2.0 g，用最適乙醇濃度溶液浸泡30 min后，在最適提取溫度和最適超聲時間下，分別設定料液比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，研究料液比對野葛塊根異黃酮提取率的影響。

1.3.5原料粒徑對野葛塊根異黃酮提取率的影響

準確稱取干燥的野葛塊根粉末2.0 g，固定其他條件為最適條件，設置原料粒徑分別為20，40，60，80，100目，研究原料粒徑對野葛塊根異黃酮提取率的影響。

1.4響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，以異黃酮提取率為響應值，選取單因素實驗中對野葛塊根異黃酮提取率影響較顯著的因素進行4因素4水平響應面試驗，確定超聲波輔助提取野葛塊根異黃酮的最適工藝參數。

1.5抗氧化性實驗設計

用分析天平準確稱取DPPH標準品10 mg，以95%乙醇溶液定容至100mL，得到10%的DPPH溶液。用移液管準確移取該溶液3mL，分別加入不同濃度的樣液各1mL，充分搖勻，置于室溫陰暗處靜置30 min，在波長517 nm處測定吸光度(Di)。同時測定1mL溶劑與3mLDPPH溶液混合后的吸光度(Dc)，以及1mL樣液與3mL95%乙醇溶液混合后的吸光度(Dj)。根據公式計算出抑制率。抗氧化能力用抑制率來表示，抑制率越大，說明抗氧化性越強，其計算公式為：

清除率(%)=[1-(Di-Dj)/Dc]×100

2　結果與分析

2.1野葛塊根異黃酮提取條件的優化實驗結果

2.1.1乙醇濃度對野葛塊根異黃酮提取率的影響

在提取溫度為50℃，料液比1∶10，超聲時間為20 min的條件下，由圖1可知，隨著乙醇濃度的增大，野葛塊根異黃酮的提取率逐漸增加，當乙醇濃度為80%時，提取率最高，之后下降。因此，乙醇濃度以80%為宜。

圖1　乙醇濃度對野葛塊根異黃酮提取率的影響Fig.1　Effects of ethanol concentrations on isoflavone extraction rate

2.1.2提取溫度對野葛塊根異黃酮提取率的影響

在乙醇濃度為80%，料液比1∶10，超聲時間20 min的條件下，由圖2可知，當超聲溫度為60℃時，野葛塊根異黃酮的提取率達到最大。因此，超聲波輔助提取的溫度宜控制在60℃。

圖2　提取溫度對野葛塊根異黃酮提取率的影響Fig.2　Effects of extraction temperature on isoflavone extraction rate

2.1.3超聲時間對野葛塊根異黃酮提取率的影響

在乙醇濃度為80%，料液比1∶10，提取溫度60℃條件下，由圖3可知，野葛塊根異黃酮的提取率隨著超聲時間的增加而增加，當提取時間延長至40 min時，提取率最高，而后有所降低。因此，超聲時間宜控制在40 min。

2.1.4料液比對野葛塊根異黃酮提取率的影響

在乙醇濃度為80%，超聲時間40 min，提取溫度為60℃條件下，由圖4可知，當料液比為1∶10時，野葛塊根中異黃酮的提取率最高，當液體比例進一步增大后，提取率明顯降低。因此，料液比以1∶10為最適條件。

圖3　超聲時間對野葛塊根異黃酮提取率的影響Fig.3　Effects of ultrasound-assisted extraction time on isoflavone extraction rate

圖4　料液比對野葛塊根異黃酮提取率的影響Fig.4　Effects of solid to liquid ratio on isoflavone extraction rate

2.1.5原料粒徑對野葛塊根異黃酮提取率的影響

在乙醇濃度為80%，超聲時間40 min，提取溫度為60℃，料液比1∶10的條件下，由圖5可知，當粒徑達40目以后，異黃酮提取率已趨于平穩。因此，從經濟方面考慮，以40目粒徑為最適條件。

圖5　原料粒徑對野葛塊根異黃酮提取率的影響Fig.5　Effects of particle size on isoflavone extraction rate

2.2響應面試驗結果

根據單因素試驗結果，原料粒徑的變化對試驗結果影響較小，故確定乙醇濃度、提取溫度、超聲時間和料液比為響應面實驗因素，固定原料粒徑為40目，以提取率為響應值，設計響應面試驗，試驗方案及結果見表1。

表1響應面試驗方案及實驗結果

Table 1Design scheme and results of response surface test

試驗號乙醇濃度/%提取溫度/℃超聲時間/min料液比/(g·mL-1)異黃酮提取率/%提取率預測值/%17550401∶102.392.5328550401∶102.482.6337570401∶102.622.6648570401∶102.882.9258060351∶52.432.5668060451∶52.692.8078060351∶152.272.3588060451∶152.492.5597560401∶52.512.53108560401∶52.762.75117560401∶152.342.34128560401∶152.502.48138050351∶102.562.51148070351∶102.712.71158050451∶102.732.72168070451∶102.902.94177560351∶102.822.73188560351∶102.972.90197560451∶103.042.93208560451∶103.233.14218050401∶52.482.33228070401∶52.642.55238050401∶152.202.11248070401∶152.342.31258060401∶103.383.42268060401∶103.493.42278060401∶103.463.42288060401∶103.403.42298060401∶103.363.42

采用Design Expert 8.0.5b軟件對表1中試驗結果進行多項擬合回歸，得到異黃酮提取率(Y)對乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、超聲時間(C)和料液比(D)的二次多項回歸模型方程：Y=-96.59533+1.66060A+0.49972B+0.71813C+0.57270D+0.00085AB+0.00040AC-0.00090AD+0.00010BC-0.00010BD-0.00040CD-0.010627A2-0.004692B2-0.009127C2-0.025077D2。

為了檢驗回歸方程的有效性，進一步確定各因素對野葛塊根異黃酮提取率的影響程度，對回歸模型進行方差分析，結果見表2。模型的F=22.90，極顯著；失擬項的P值為 0.060 1，不顯著，說明數據沒有異常點；決定系數R2=0.958 2，說明響應值的變化中有95.82%來源于所選因素，表明模型擬合度好，回歸方程能很好地描述各因素與響應值之間的關系，方法可靠。

回歸模型中一次項A達到顯著水平，而B，C，D均達到極顯著水平；二次項中4個因素的P值均小于0.01，說明試驗中4個因素的二次項都具有極顯著影響，表明實驗因素與響應值不是簡單的線性關系；但4個因素兩兩交互項不顯著。考查P值與F值大小，可得各因素對野葛塊根異黃酮提取率的影響，依次為料液比(D)>超聲時間(C)>提取溫度(B)>乙醇濃度(A)。

用Design Expert 8.0.5b軟件對二次多項式回歸方程進行計算，確定最適的提取條件為：乙醇濃度80.95%、提取溫度61.22℃、超聲時間41.24 min、料液比1∶9.52，在原料粒徑為40目下，預測提取率為3.452%。考慮到實際操作的局限性，提取工藝最終修正為：乙醇濃度81.0%、提取溫度61.2℃、超聲時間41.2 min、料液比(m/V)1∶9.5(g·mL-1)、原料粒徑為40目。此條件下進行試驗驗證，設置4個試驗組，每組平行測定3次，如表3所示，野葛塊根異黃酮實際提取率為3.43%，與預測值接近。

表2響應面回歸模型方差分析

Table 2ANOVA results of the constructed response surface regression

方差來源平方和自由度均方FP顯著性模型3.98140.2822.90<0.0001**A0.1010.108.130.0128*B0.1310.1310.490.0059**C0.1510.1511.700.0041**D0.1610.1612.600.0032**AB0.00722510.0072250.580.4581AC0.00040010.0004000.0320.8601AD0.00202510.0020250.160.6924BC0.00010010.0001000.0080580.9297BD0.00010010.0001000.0080580.9297CD0.00040010.0004000.0320.8601A20.4610.4636.89<0.0001**B21.4111.41113.95<0.0001**C20.3410.3427.210.0001**D22.5512.55205.43<0.0001**殘差0.17140.012失擬項0.16100.0165.350.0601純誤差0.01240.00302總和4.1528R20.9582

注：**表示極顯著(P<0.01)；*表示顯著(P<0.05)。

對常規浸提方法與超聲輔助浸提工藝進行比較，即在最適工藝的基礎上取消超聲輔助處理步驟。同樣設置4個處理組，每組重復3次。由表3可知，常規方法下野葛塊根異黃酮提取率平均僅為2.53%，超聲波輔助浸提法提取效率較常規方法具有明顯優勢。

表3常規方法與優化方法的野葛塊根異黃酮提取率

Table 3The extraction rate of isoflavones by regular or optimized extraction method

試驗組提取率/%常規方法超聲輔助浸提12.52±0.063.42±0.0622.50±0.093.45±0.0432.55±0.033.41±0.0742.52±0.063.42±0.04平均值2.53±0.063.43±0.05

注：表中數據代表平均值±標準差，下同。

2.3野葛塊根異黃酮對DPPH自由基的清除作用

為了確定野葛塊根異黃酮的抗氧化能力，測定了其對DPPH自由基的清除作用，結果見圖6。隨著野葛塊根異黃酮和Vc濃度的增加，二者對自由基的清除率均逐漸增加，當濃度大于0.6 mg·mL-1時，二者對自由基的清除率增速均漸趨平緩；將異黃酮和Vc按1∶1體積混合后，其對DPPH的清除效果強于異黃酮提取物單體。總體而言，野葛塊根異黃酮對羥基自由基的清除率低于Vc，但能與Vc產生一定的協同效應。

圖6　野葛塊根異黃酮和Vc對自由基的清除效果Fig.6　The radical-scavenging effect of Vc and extracted isoflavone

3　討論

黃酮類化合物一般易溶于水、乙醇等極性強的溶劑中，難溶于或不溶于苯、氯仿等有機溶劑中，且乙醇對細胞膜的破壞作用比水強，使得黃酮類化合物更易溶出，故本研究選擇乙醇作為提取溶劑[13]。通過對加熱回流法、微波輔助萃取法、超聲波輔助提取法、常規浸提法等提取異黃酮的方法進行比較，發現超聲波輔助提取法能加快野葛細胞破碎的速度、降低能耗、節省時間，且提取的產品純度較高[14]，因此，本試驗選擇超聲波輔助乙醇提取法提取野葛塊根中的異黃酮。

單因素及響應面試驗結果表明，超聲波輔助乙醇法提取野葛塊根異黃酮時，各因素對異黃酮提取效果的影響依次為料液比>超聲時間>提取溫度>乙醇濃度。最適提取條件為：乙醇濃度81.0%，超聲時間41.2 min，提取溫度61.2℃，料液比1∶9.5，原料粒徑為40目；在此條件下，異黃酮的提取率為3.43%，較常規浸提法的提取率高出近1個百分點，極大地提高了野葛塊根異黃酮的生產效率，且節約能耗，在實際生產中具有較好的應用前景。

DPPH自由基是一種非常穩定的以氮為中心的自由基，在517 nm處有一強吸收峰，黃酮類化合物的電子可與其孤對電子配對，使其在517 nm處吸光度變小，吸光值的變化即可反映樣品對自由基的清除能力[15]。在本研究中，隨著野葛塊根異黃酮濃度的增加，其對自由基的清除率也逐漸增加，但略低于Vc，說明野葛塊根異黃酮具有一定的抗氧化活性。

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(責任編輯高峻)

Extraction and antioxidant effects of isoflavone in Pueraria lobata (Willd.) Ohwi root tuber

LI Ling1，2，TAN Li1，QUAN Qin-guo3，QUAN Hao1，HE Fu-lin1，HUANG Guang-wen1，SHAO Jin-hua1，YAN Xu-yu1，*

(1.Department of Chemistry and Biological Engineering，Hunan University of Science and Engineering，Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South，Yongzhou 425199，China;2.College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China;3.Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Laboratory of Agro-products Quality Safety Risk Assessment，Ministry of Agriculture，Beijing 100193，China)

In the present study，isoflavone was extracted from Pueraria lobata(Willd.) Ohwi root tuber collected in Tujia Mountain by ultrasound-assisted ethanol extraction.Based on single factor test analysis，main technology parameters of the extraction process were optimized by response surface design of 4 factors and 4 levels，and antioxidant effects of the extracted isoflavone were also studied.The results showed that the optimum extraction technology was as follows:the ethanol concentration was 81.0%，ultrasound-assisted extraction time was 41.2 min，extraction temperature was 61.2℃，solid to liquid ratio (m/V) was 1∶9.5，and particle size of raw material was 40 mesh.Under this condition，the extraction rate of isoflavone reached 3.43%.The antioxidant effects of the extracted isoflavone were weaker than that of vitamin C，but it could yield synergetic effect with vitamin C.

Pueraria lobata(Willd.) Ohwi;isoflavone;antioxidants

浙江農業學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):496-501http://www.zjnyxb.cn

李玲，譚力，全沁果，等.野葛塊根異黃酮的提取及抗氧化研究[J].浙江農業學報，2016，28(3)： 496-501.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.22

2015-08-10

中國博士后科學基金面上項目(2014M561768)；湖南科技學院湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室開放基金(XNZW14C12)；湖南省永州市2015年度指導性科技計劃項目(2015-10)；永州市科技創新項目(永財企指2015[25]號-9)

李玲(1982—)，女，山西長治人，博士，副教授，研究方向為植物生物技術。E-mail:liling7826@126.com

，閆旭宇，E-mail:yanxuyu1979@163.com

S58；TQ464

A

1004-1524(2016)03-0496-06