杏鮑菇發酵液對3種植物病菌的抑制作用

侯潞丹，吳　穎，張　杰

(山西師范大學 生命科學學院，山西 臨汾 041004)

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杏鮑菇發酵液對3種植物病菌的抑制作用

侯潞丹，吳穎，張杰*

(山西師范大學 生命科學學院，山西 臨汾 041004)

杏鮑菇是一種重要的具有食用價值和藥用價值的真菌，其發酵液中含有大量的次級代謝產物。文章初步探究了杏鮑菇發酵液對尖鐮孢菌、鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌3種植物病菌的抑制作用。結果表明：發酵液使3種病菌菌絲均表現出溶菌現象；發酵液原液對3種病菌菌絲生長速度及孢子萌發影響最大，其抑菌率依次為尖鐮孢菌(92.78%)>鏈格孢菌(89.76%)>禾谷鐮孢菌(87.45%)；其孢子萌發抑制率依次為禾谷鐮孢菌(79.45%)>鏈格孢菌(72.25%)>尖鐮孢菌(52.32%)。由此可見，杏鮑菇發酵液中的確存在對植物病菌有抑制作用的物質，進而為生物制劑的開發提供依據。

杏鮑菇發酵液；植物病害菌；抑制作用

食用菌是一種重要的生物資源，其液體發酵可以在短時間內獲得大量菌絲體及其代謝產物，由于這一過程周期短、產量高、成本較低，因此在食用菌生產中具有廣闊的應用前景[1]。食用菌菌渣是食用菌栽培過程中收獲產品后剩下的培養基廢料，其中含有大量的菌絲殘體、纖維素、半纖維素等物質，特別是含有大量食用菌次級代謝產物。它常可用于栽培基質、作物基肥、飼料添加物等[2-3]。陳慶榆等[4]研究表明，一定比例的菌渣施用可促進青菜生長，提高產量。馬嘉偉等[5]探究得出菌渣化肥配施可顯著提高稻谷生物量和稻谷產量，鄭寧等[6]也得出了相似的結論；胡清秀等[7]則發現，適量的菌渣可以減少稻谷空癟粒，提高水稻產量，但他們并沒有對其具體緣由作出探究。楊昌躍等[8]研究得出有30株不同真菌的代謝產物對煙草黑脛病具有較強的抑制作用。因此，對真菌代謝產物進行研究具有重要意義。

鏈格孢菌(Alternaria alternata)、尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum .f.sp.cucmrium)、禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)是3種常見真菌病原菌，其可通過菌絲及孢子進行快速繁殖，且在適宜條件下可快速侵染植株使其致病。其寄主范圍廣、對環境和基質的適應性強且廣泛分布，是重要的植物病原菌[9]。對于這3種植物病菌引起的疾病目前多采用化學制劑的防治方法，但是長期使用會破壞生態平衡。因此，生物防治迫在眉睫。目前，有關食用菌代謝物對植物病菌進行生物防治的研究報道極少。因此，本試驗探究了杏鮑菇發酵液對3種病菌的防治效果，不僅為這3種病菌的生物防治提供依據，而且為食用菌資源的開發利用及生物制劑的開發提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1供試菌株

杏鮑菇(Pleurotus eryngii)菌種，購自于四川省農業科學院微生物研究中心。

尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum .f.sp.cucmrium)、鏈格孢菌(Alternaria alternata)、禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)由山西師范大學生命科學學院培養保存。

1.1.2培養基的配制

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH值自然。

搖瓶種子培養基：馬鈴薯200 g，麩皮40 g(煮汁)，葡萄糖20 g，MgSO41.0 g，KH2PO41.5 g，水1 000 mL，pH值自然[10]。

液體發酵培養基：馬鈴薯100 g，麩皮30 g，紅糖15 g，葡萄糖11 g，蛋白胨1.5 g，MgSO40.9 g，KH2PO41.5 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.2試驗方法

1.2.1搖瓶種子的制備

在無菌條件下，從活化好的斜面菌種中挑取3塊大小均勻的菌塊，接入搖瓶種子培養基中，26℃、120 r·min-1搖床振蕩培養6 d獲得搖瓶種子。

1.2.2發酵液的制備

按10%的接種量，將搖瓶種子接入發酵培養基中，其發酵培養基搖瓶為250 mL的三角瓶，裝液量為100 mL，26℃，120 r·min-1搖床振蕩培養6 d。采用無菌操作技術，取液體發酵培養基各30 mL于50 mL離心管中，于5℃，4 000 r·min-1條件下離心20 min，所得上清液即為杏鮑菇發酵液。

1.2.3搭片培養3種病菌

以加有發酵液的PDA培養基為實驗組，以加無菌水的PDA培養基為對照組，采用搭片法對3種植物病菌進行搭片培養5 d，共聚焦顯微鏡進行形態觀察。

1.2.4菌絲生長速度的測定

在無菌條件下，取制備好的不同濃度發酵液5 mL，加入到無菌培養皿中，且將冷卻至45℃的PDA培養基倒入培養皿15 mL，每皿共20 mL，待其凝固后備用。以無菌水為對照。

取病菌菌種分別接種到制備好的培養基平板上，每個培養皿接種1個菌餅，每組3次重復，以無菌水為對照；28℃培養5 d，采用十字交叉法測量菌落直徑。

菌落純生長量(D)、抑制率(P)的計算公式分別為：

D=d1-d2

P=(D1-D2)/ D1× 100%

式中：d1—菌落平均直徑(cm)；d2—菌餅直徑(cm)；D1—對照純生長量(cm)；D2—處理純生長量(cm)[11]。

1.2.5孢子萌發抑制率的測定

采用蓋玻片培養法[12]，將3種植物病菌接種至PDA斜面，培養7 d，使其產生大量孢子，備用；將10 mL無菌水加入到試管內，反復吹打，制備孢子懸浮液，再將孢子懸浮液適當稀釋，直至在400倍顯微鏡視野下觀察到50～100個孢子為宜；將制備好的發酵液分別稀釋10，100倍備用。孢子懸浮液與粗提液各取5 mL分別加入培養皿中，再取蓋玻片于培養皿中。以無菌水為對照，每組4次重復，12℃培養14 h。顯微鏡檢孢子萌發數。

孢子萌發抑制率=(對照孢子萌發率-處理孢子萌發率)/對照孢子萌發率×100%[13]

2　結果與分析

2.1發酵液對尖鐮孢菌、鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌菌絲形態的影響

取發酵液處理5 d的3種植物病菌菌絲，共聚焦顯微鏡觀察，結果如圖1所示：鏈格孢菌實驗組菌絲生長不正常，圖中紅色箭頭表明其菌絲發生扭曲變形且多處斷裂；尖鐮孢菌實驗組與對照組相比較：實驗組菌絲多處溶斷，菌絲形態不完整；禾谷鐮孢菌對照組菌絲生長正常，粗細均勻，孢子呈現鐮刀狀，而實驗組菌絲發生彎曲并多處溶斷，且菌絲畸形，不能正常生長。

2.2發酵液對尖鐮孢菌、鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌菌絲生長速度的抑制作用

表1數據顯示，杏鮑菇發酵液對尖鐮孢菌、鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌的菌絲生長速度均有顯著的抑制作用，抑菌率分別為92.78%，89.76%，87.45%；3種植物病菌菌落純生長量從大到小依次為禾谷鐮孢菌0.97 cm·d-1、鏈格孢菌0.43 cm·d-1、尖鐮孢菌0.33 cm·d-1。

從圖2可以得出：不同濃度的杏鮑菇發酵液對鏈格孢菌、尖鐮孢菌及禾谷鐮孢菌的菌絲生長速度均有顯著的抑制作用，且隨著發酵液濃度的升高，菌落生長速度明顯減緩。同時由圖可得在平板培養5 d后，3種植物病菌不同處理組之間菌落大小均表現出顯著性差異(P<0.05)，由此得出：不同濃度發酵液對菌絲生長速度的抑制作用從大到小依次為原液、稀釋10倍、稀釋100倍、水。

圖中紅色箭頭所指為菌絲扭曲或溶斷處圖1　三種植物病菌菌絲顯微圖(400×)Fig.1　The microscope images of the 3 fungi(400×)

表1發酵液對菌絲生長的抑制作用

Table 1Inhibition effect of fermented filtrates on the mycelia growth

菌種名稱菌落純生長量/(cm·d-1)抑菌率/%尖鐮孢菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucmrium)0.3392.78鏈格孢菌(Alternariaalternata)0.4389.76禾谷鐮孢菌(Fusariumgra-minearum)0.9787.45

2.3發酵液對尖鐮孢菌、鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌孢子萌發的抑制效應

表2表明，隨著發酵液濃度的升高，尖鐮孢菌孢子萌發率越低。與CK相比，當發酵液稀釋100倍時，尖鐮孢菌孢子萌發率顯著降低，此時孢子萌發率為41.42%；當其發酵液稀釋10倍時，孢子萌發率為39.65%，兩組間孢子萌發率差異性不大；當使用未經稀釋的發酵液時，孢子萌發率降低至30.23%，與稀釋10倍、稀釋100倍組相比差異顯著。由表2可知，不同濃度發酵液對尖鐮孢菌孢子的抑制率從大到小依次為：原液(52.32%)、稀釋10倍(37.93%)、稀釋100倍(34.67%)。

圖中同一種菌不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖2　不同濃度發酵液對3種植物病菌菌落大小的影響Fig.2　Effect of different concentrations of fermented filtrates on the size of colony of 3 fungi

表2發酵液對尖鐮孢菌孢子萌發的抑制效應

Table 2Inhibition effect of different concentrations of fermented filtrates on spore germination of Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium

發酵液稀釋倍數孢子平均萌發數萌發率/%萌發抑制率/%原液22.67±9.0230.23±5.27c52.32稀釋10倍30.00±2.0039.65±1.57b37.93稀釋100倍33.00±9.6441.42±6.09b34.670(CK)58.33±5.1363.40±7.76a0

注：表中同列不同行數據后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

由表3可知，發酵液對鏈格孢菌孢子萌發的抑制作用的隨著濃度的升高而增強。當發酵液稀釋100倍時，孢子萌發率為38.63%，與CK相比顯著降低；當其發酵液稀釋10倍時，孢子萌發率降低至24.85%；當其發酵液為原液時，鏈鉻孢菌孢子萌發率顯著降低至23.40%，與CK的萌發率(71.28%)相比較差異顯著。同時由表3可以得出，不同濃度對鏈格孢菌孢子萌發的抑制作用依次為原液(72.25%)、稀釋10倍(65.14%)、稀釋100倍(45.81%)。

表3發酵液對鏈格孢菌孢子萌發的抑制效應

Table 3Inhibition effect of different concentrations of fermented filtrates on spore germination of Alternaria alternata

發酵液稀釋倍數孢子平均萌發數萌發率/%萌發抑制率/%原液9.33±2.0823.40±5.70c72.25稀釋10倍12.33±1.1524.85±1.96c65.14稀釋100倍22.33±1.5338.63±4.36b45.810(CK)54.00±4.5871.28±4.10a0

表4表明，發酵液對禾谷鐮孢菌孢子萌發的抑制效果極為明顯，發酵液濃度越高，抑制作用越顯著，且各組之間萌發率均有顯著性差異(P<0.05)。當發酵液稀釋100倍時，孢子萌發平均數為19.67，萌發率75.77%，抑制率為20.76%；當稀釋10倍時，孢子萌發平均數為16.67，萌發率降低為32.76%，萌發抑制率高達65.74%；當發酵液為原液時，孢子萌發平均數僅為10.33，萌發率最低為19.65%，其抑制率最高為79.45%。

表4發酵液對禾谷鐮孢菌孢子萌發的抑制效應

Table 4Inhibition effect of different concentrations of fermented filtrates on spore germination of the Fusarium graminearum

發酵液稀釋倍數孢子平均萌發數萌發率/%萌發抑制率/%原液10.33±2.5219.65±6.43d79.45稀釋10倍16.67±3.2132.76±5.19c65.74稀釋100倍19.67±4.7375.77±7.89b20.760(CK)57.67±1.5395.62±1.71a0

3　結論與討論

本試驗表明，杏鮑菇發酵液對3種病菌菌絲均表現出溶菌現象，菌絲細胞壁結構遭到破壞，原因可能是由于發酵液中含有與該病菌相應的胞壁降解酶等物質，使病菌菌絲細胞壁溶解斷裂，破壞了其正常結構，導致其不能正常生長，進而在一定程度上抑制了病菌菌絲的繁殖。

同時試驗結果表明，發酵液原液對3種病菌菌絲生長速度及孢子萌發影響很大，其抑菌率依次為尖鐮孢菌(92.78%)>鏈格孢菌(89.76%)>禾谷鐮孢菌(87.45%)；其孢子萌發抑制率依次為禾谷鐮孢菌(79.45%)>鏈格孢菌(72.25%)>尖鐮孢菌(52.32%)。由此可得杏鮑菇發酵液中可能含有抗菌物質，該物質對這3種植物病菌的孢子萌發抑制作用顯著，從根源上對病菌的繁殖進行了抑制。

韓燕峰等[14]通過平板抑菌實驗探究得出蛹蟲草菌株發酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定抑制作用；楊雯雯等[15]研究了真姬菇發酵液的抑菌活性，得出其發酵液對6種細菌有一定的抑制作用，對枯草芽孢桿菌和4種霉菌基本無抑制作用；周金鳳等[16]探究得出靈芝培養基發酵液粗提物對蘋果炭疽病菌、小麥根腐病菌和西瓜枯萎病菌具有顯著的抑菌活性，本試驗得出了與其相似的結論，證明了杏鮑菇發酵液中存在抑菌活性物質。且據報道，食用菌發酵液中的有效抑菌成分主要是一些小分子質量的蛋白、多肽、多糖、有機酸、揮發油倍半萜、酚和有機酸類物質等[17-18]，但是由于目前國內外有關食用菌發酵代謝產物抑菌作用的研究報道極少，因此本研究從新的角度來研究真菌，為其開發利用提供了依據。由于杏鮑菇在發酵過程中會產生多種次級代謝產物，我們只對其進行了初期的研究，對其構效關系和機理并不清楚，需要進一步的探索和研究。

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(責任編輯張韻)

Inhibition effect of fermented filtrates of Pleurotus eryngii on 3 plant fungi

HOU Lu-dan，WU Ying，ZHANG Jie*

(College of Life Sciences，Shanxi Normal University，Linfen 041004，China)

Pleurotus eryngii is a very important edible and medical mushroom，whose fermented filtrates contain a lot of secondary metabolites.The inhibition effect of the fermented filtrates from Pleurotus eryngii on the growth of Alternaria alternata，Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium and Fusarium graminearum was investigated.The results showed that the fermented filtrates from Pleurotus eryngii showed the lysis phenomenon and it had significant inhibition effects on pathogen mycelial growth and spore germination.The inhibitory rate of the extracts against the mycelial growth showed as Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium (92.78%)>Alternaria alternata (89.76%)>Fusarium graminearum (87.45%) and the inhibitory rate against the spore germination were Fusarium graminearum (79.45%)>Alternaria alternata (72.25%)>Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium (52.32%).Therefore，there were the anti-pathogenic materials in fermented filtrates of Pleurotus eryngii，which could lay the foundation for the development of bio-inhibitor.

fermented filtrates of Pleurotus eryngii;plant pathogenic fungi;inhibition effect

浙江農業學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):469-473http://www.zjnyxb.cn

侯潞丹，吳穎，張杰.杏鮑菇發酵液對3種植物病菌的抑制作用[J].浙江農業學報，2016，28(3)： 469-473.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.18

2015-08-18

山西師范大學科技開發基金項目(一般項目)(YK1201)

侯潞丹(1990—)，女，山西晉城人，碩士研究生，從事應用微生物的研發。E-mail∶347949871@qq.com

，張杰，E-mail∶604072014@qq.com

S476;Q939.96

A

1004-1524(2016)03-0469-05