兔出血癥病毒SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

王　波，李桂黎，王　印，姚學萍，楊澤曉

(四川農業大學　動物醫學院，四川 成都　611130)

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兔出血癥病毒SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

王波，李桂黎，王印，姚學萍，楊澤曉*

(四川農業大學動物醫學院，四川 成都611130)

兔病毒性出血癥(rabbit hemorrhagic disease，RHD)是一種具有高度傳染性的疾病，嚴重威脅養兔業的健康發展。為了建立一種能夠快速、高效、敏感的檢測RHDV的方法，試驗設計了一對特異性引物進行PCR擴增，得到RHDV VP60基因中979 bp的保守序列，并將其克隆到pMD19-T載體中作為標準品建立標準曲線；在擴增區域內設計一對簡并引物，建立SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測方法，優化反應條件，并驗證該方法的敏感性、特異性、重復性。結果表明：該方法可檢測到的模板的最低拷貝數為8.18×101copies，只能特異性擴增RHDV，pGM19-T-EBHSV、兔巴氏桿菌、兔沙門氏菌、兔大腸埃希菌和健康兔組織RNA的擴增均為陰性，具有良好的特異性和重復性；同時用此方法對人工感染家兔的內臟分別進行檢測，結果表明SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR能快速檢測到不同臟器中的兔病毒性出血癥病毒RNA含量，可用于臨床兔瘟病毒的檢測。

兔病毒性出血癥病毒(RHD)；VP60；SYBR Green Ⅰ；實時熒光定量PCR

兔病毒性出血癥(rabbit hemorrhagic disease，RHD)是一種急性的、具有高度傳染性、高致死性的疾病[1]，又稱兔瘟。它由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起，在自然條件下主要侵害青年兔和成年兔，2月齡以下的仔兔自然感染時一般不會發病死亡。兔瘟病毒感染兔群時發病率和死亡率高達90%～100%，已成為嚴重危害養兔業健康發展的一種疾病。1984年該病首先在我國江蘇省暴發[2]，隨后歐、亞、美、澳四大洲的一些國家均報道有本病流行[3]，隨著世界各地關于兔瘟報道的增多，說明兔瘟現在已呈現出全球流行性[4-5]。世界動物衛生組織在1989年將兔瘟列為B類傳染病，我國也將其列為二類傳染病。

RHDV屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)兔病毒屬(Lagovirus)[6]，是沒有囊膜的、單股正鏈RNA病毒[7]。目前被廣泛用來檢測的方法主要有：血凝試驗、Western blot、酶聯免疫吸附試驗、免疫瓊擴試驗、RT-PCR等。這些方法的前期準備比較煩瑣、耗時費力，而且試驗敏感性低，SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR作為熒光定量PCR方法中的一種，當熒光染料嵌合于DNA雙鏈結構的小溝部位后，會發射熒光信號，隨著PCR反應的進行，SYBR Green Ⅰ不斷與新合成的dsDNA結合，熒光強度隨著聚合反應的進行逐漸增加，便可被熒光探測系統檢測到[8]，熒光強度又與初始模板濃度量相關，既可定性檢測也可定量檢測?？紤]到RHDV的變異，本研究根據GenBank中已公布RHDV VP60基因序列設計1對簡并引物，對兔瘟病毒的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量檢測方法進行了初步研究。

1　材料與方法

1.1主要試劑

熒光定量SYBR Green Ⅰ染料購買自生工生物工程(上海)股份有限公司；病毒基因組RNA提取試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒、質粒提取試劑盒購買自天根生化科技(北京)有限公司；反轉錄試劑盒購買自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞由四川農業大學動物檢疫實驗室制備并保存。

1.2毒株

感染兔出血癥病毒(RHDV)的病料、兔巴氏桿菌病菌種、兔沙門氏菌病菌種、兔大腸埃希菌菌種、健康兔組織由四川農業大學動物醫學院實驗室保存；歐洲野兔綜合征病毒(EBHSV)重組陽性質粒由四川農業大學動物醫學院實驗室王印[9]老師構建并保存。

1.3引物的設計與合成

在NCBI上下載已公布的RHDV VP60基因序列若干條，用DNAStar進行比對分析，利用Beacon Designer 8軟件在其保守區設計一對特異性引物F1，F2，可擴增VP60基因的片段長度為979 bp，上游引物F1：5′-TCACTGGTGTTGGCAATG-3′，下游引物F2:5′-CAGACATAAGAAAAGCC-3′；在F1，F2引物的擴增區域內，設計1對SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR引物P1(5′-TGGAGATYGGTTTRAGTG-3′)，P2(5′-AATGAGTTCAGTCARGTCAA-3′)，可擴增的片段為165 bp。引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.4病毒RNA的提取及反轉錄

根據病毒基因組RNA提取試劑盒說明書提取組織中病毒RNA，作為模板進行反轉錄，反轉錄體系為10.0 μL，其中5×PrimeScript Buffer 2.0 μL，RNase Free dH2O 2.0 μL，Ramdom 6 mers 2.0 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，RNA 3.0 μL。反轉錄程序為：37℃ 15 min，87℃ 5 s。得到cDNA，-20℃保存。

1.5VP60基因的PCR擴增和質粒的構建

用反轉錄得到的cDNA作模板進行PCR擴增，擴增的反應總體系為20.0 μL：其中2×Taq Master Mix 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，F1、F2各1.0 μL(10 μmol·L-1)，加超純水至20.0 μL。反應程序為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃延伸10 min。擴增后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

將目的片段純化回收，把回收的DNA連接到pMD19-T載體，再轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，構建重組質粒pMD-19T-VP60，經PCR鑒定后，將陽性質粒送北京擎科新業生物技術有限公司測序鑒定。將構建的質粒pMD-19T-VP60利用核酸蛋白儀測定其在260和280 nm處的吸光度，計算出DNA的濃度和純度，之后將其進行10倍梯度稀釋，作為陽性定量的標準模板，進行熒光定量PCR的擴增和建立標準曲線。

1.6實時熒光定量PCR的擴增及標準曲線的建立

將簡并引物P1和P2進行PCR擴增，反應條件和反應程序同上，擴增后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，驗證引物是否合理。

用陽性質粒做模板進行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR擴增，將其反應條件和反應程序進行優化，確定其最佳反應條件和反應程序；將重組質粒進行10倍梯度稀釋，作為熒光定量PCR擴增的模板，建立SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR擴增的標準曲線。

1.7特異性試驗

將實驗室保存的歐洲野兔綜合征病毒重組質粒、兔巴氏桿菌病菌種、兔沙門氏菌病菌種和兔大腸埃希菌菌種復蘇，用菌液當模板，進行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR擴增。

1.8敏感性試驗

將制備的陽性質粒標準品按10倍梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增，以此來測定熒光定量PCR所能檢測出來的模板的最低拷貝數。

1.9重復性試驗

用同一次提取的不同濃度的陽性質粒作為模板，在同一次試驗中做3個重復，進行熒光定量PCR 擴增，測定標準品的穩定性，同時做陰性對照。

1.10初步應用

將含RHDV的病料組織研磨液經過過濾后，取1 mL對健康成年家兔(3只)進行腹腔注射，3 d后家兔死亡。分別取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟提取RNA，反轉錄為cDNA，用建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法進行檢測，同時與普通RT-PCR[10]的檢測結果進行比較。

2　結果與分析

2.1VP60基因的PCR擴增

從實驗室保存的病料中提取RNA，將其反轉錄成cDNA后用F1，F2和P1，P2分別進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后分別得到979 bp的目的片段(圖1-A)和165 bp的目的片段(圖1-B)，均無雜帶，與預期的結果相符。

M： DL2000 Marker；1： 病料擴增產物;2： 靶基因擴增產物圖1　RHDV VP60和靶基因PCR擴增Fig.1　PCR results of RHDV VP60 and target gene

2.2質粒的構建

將PCR擴增產物用0.8%瓊脂糖凝膠純化回收，連接到pMD19-T載體，轉化到大腸埃希菌DH5α感受態細胞，構建重組質粒pMD-19T-VP60，將其測序結果直接在NCBI上BLAST，得到的結果與RHDV VP60基因的同源性為96%。用核酸蛋白儀測定其濃度為32.9 mg·L-1，pMD-19T長度為2 692 bp，引物擴增長度為979 bp，DNA length=載體長度+引物擴增片段，即DNA length=(2692+979)bp=3671 bp，根據拷貝數計算公式：(6.02×1023)×質粒濃度(g·mL-1)/DNA length×660=copies·mL-1，得到重組質粒DNA拷貝數：(6.02×1023×32.9×10-6)μg·mL-1/(3671×660)=8.18×1012copies·μL-1。

2.3熒光定量PCR標準曲線的建立

將陽性質粒經10倍梯度稀釋后選取8.18×107～8.18×1012拷貝數的樣品作為模板進行熒光定量PCR擴增，通過對引物濃度的優化、退火溫度的優化和各程序反應時間的優化，最終確定的最佳反應條件和反應程序為：在20.0 μL的反應體系中，2×SG Fast qPCR Master Mix 10.0 μL，P1和P2各加0.5 μL，DNF Buffer 2.0 μL，模板2.0 μL，滅菌超純水5.0 μL；反應程序為：95℃ 3 min；95℃ 5 s，57℃ 10 s，72℃ 30 s，共40個循壞；生成動力學曲線(圖2)和標準曲線(圖3)。由圖可見，NTC無特異性擴增，在所測定的范圍內標準品與Ct值之間存在線性關系，線性回歸方程Ct=-3.383×lgcopies+34.946(R2=0.997)。

2.4特異性試驗

用建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR反應體系對RHDV陽性質粒、EBHSV陽性質粒、兔巴氏桿菌、兔沙門氏菌、兔大腸埃希菌和兔健康組織RNA進行熒光定量PCR檢測，結果表明所設計的引物只能特異性的擴增RHDV，對EBHSV陽性質粒、兔巴氏桿菌、兔沙門氏菌等的檢測結果均為陰性(圖4)，說明所建立SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法具有很好的特異性。

1,8.18×1012 copies·mL-1;2,8.18×1011 copies·mL-1;3,8.18×1010 copies·mL-1;4,8.18×109 copies·mL-1;5,8.18×108 copies·mL-1;6,8.18×107 copies·mL-1;7,NTC(ddH2O)。圖2　SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR動力學曲線Fig.2　The amplification of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

圖3　標準曲線Fig.3　The standard curve of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

1:RHDV;2:pGM-T-EBHSV;3:兔巴氏桿菌;4： 兔沙門氏菌;5： 兔大腸埃希菌;6： 健康兔組織RNA;7:NTC(ddH2O)。圖4　SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR的特異性試驗Fig.4　The specificity assay of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

2.5敏感性試驗

將制備的陽性質粒10倍梯度稀釋后，作為模板進行熒光定量PCR擴增，得到的擴增曲線(圖5)顯示，在8.18×100copies時與陰性對照結果基本重合，說明其靈敏度為8.18×101copies。

2.6重復性試驗

選取質粒濃度為8.18×1012～8.18×107copies·mL-1的樣品模板按制備標準曲線的反應程序和反應條件進行熒光定量PCR擴增，所得到的樣品Ct值在組內的變異系數分別為1.12%，0.34%，0.36%，0.23%，0.51%，0.29%(表1)，而Tm值一直維持相同的數值(81℃)，同時，從PCR擴增曲線(圖6)可以看出每個樣本的3條S曲線之間的誤差都不到1個循環，說明此方法具有良好的重復性和準確性。

1,8.18×106 copies;2,8.18×105 copies;3,8.18×104 copies;4,8.18×103 copies;5,8.18×102 copies;6,8.18×101 copies;7,8.18×100 copies;8,NTC(ddH2O)。圖5　SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR的靈敏度試驗Fig.5　The sensitivity assay of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

表1SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR重復性試驗

Table 1The reproducibility assay of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

質粒濃度/(8.18×10n)Ct值(n=3)平均值標準差變異系數CV/%1012313.430.1511.121011317.620.0600.341010320.890.0770.36109324.440.0570.23108327.050.1480.51107330.910.0920.29

1,8.18×1012 copies·mL-1;2,8.18×1011 copies·mL-1;3,8.18×1010 copies·mL-1;4,8.18×109 copies·mL-1;5,8.18×108 copies·mL-1;6,8.18×107 copies·mL-1;7,NTC(ddH2O)。圖6　SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR的重復性試驗Fig.6　The reproducibility assay of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

2.7初步應用

用建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR法和普通RT-PCR法同時對實驗室人工感染家兔的內臟分別進行檢測，擴增完成后系統自動分析得到各臟器的Ct值(表2)，根據Ct值的大小與各臟器的含毒量相關性可知臟器中含毒量最多的是脾臟。普通RT-PCR方法的檢測結果(圖7)顯示脾臟的條帶最清晰，病毒含量最高，而心臟、肺臟的條帶不明顯，病毒含量相對較低，與SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測結果相符合，表明熒光定量PCR方法在RHDV的檢測中不僅可以定量檢測，而且具有更高的敏感性。

表2人工感染家兔內臟的Ct值

Table 2The Ct value of artificial infection rabbits

人工感染兔心臟肝臟脾臟肺臟腎臟A(Ct)28.0525.4018.6922.2235.45B(Ct)33.6121.2819.3531.2229.55C(Ct)23.8023.9021.8223.6126.40

M:DL2000 Marker；1： 心臟；2： 肝臟；3： 脾臟；4： 肺臟；5： 腎臟。圖7　家兔內臟RHDV RT-PCR檢測部分結果Fig.7　RT-PCR detection of rabbit organs

3　討論

實時熒光定量PCR方法是20世紀90年代發展起來的一種新型核酸定量技術。目前，在臨床醫學和生命科學領域都得到了廣泛的應用，已成為病毒含毒量檢測的常用方法[11]，它解決了傳統PCR方法在DNA序列擴增和之后的產物分析中量化困難的問題。SYBR Green Ⅰ染料法與熒光探針法相比，染料法不需設計、標記熒光探針，成本更低；另外，DNA在擴增和分析的過程都在同樣的封閉系統完成，避免了樣品和產物的污染，而且不需要進行PCR后續的實驗處理或電泳檢測，更加省時，操作更簡便，可直接進行定性分析和定量分析，具有很好的實用性。

兔瘟自暴發以來，已給養兔業造成了嚴重的經濟損失，亞洲、歐洲、澳洲對于兔瘟的報道也越來越多[12-13]，近年來雖有所控制，但仍有散發的報道。所以，建立一種快速、準確、省時的檢測方法很有必要?？紤]到RHDV存在基因突變，本試驗通過在RHDV VP60序列的保守區設計簡并引物，并優化引物濃度、退火溫度及反應程序，成功建立了一種SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測方法。簡并引物具有相對較寬的檢測范圍，解決了因基因變異引起的難以擴增的問題，國內尚無使用簡并引物檢測RHDV的熒光RT-PCR研究的公開報道。2015年，Liu等[14]報道設計1對普通特異性引物建立了一種RHDV SYBR Green Ⅰ 熒光RT-PCR方法，并對臨床樣品和人工感染樣品進行了檢測，結果顯示，受檢樣品中脾臟含毒量最多，這與本研究的檢測結果一致。然而2007年張秀娥等[15]報道用建立的RHDV TaqMan MGB熒光RT-PCR檢測方法，并對人工感染家兔內臟的病毒含量進行檢測，結果顯示，病毒在肝臟含量高于脾臟、血液、心臟、肺臟、腎臟和體液，這可能與病毒感染劑量或者感染途徑有關。本研究采用一對帶有簡并堿基的引物通過反應條件優化、特異性試驗、敏感性試驗、標準曲線建立和人工感染樣品的檢測應用建立了RHDV的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法，該方法能檢測到的陽性質粒標準品的最低拷貝數為8.18×101copies，樣品的組內變異系數為0.23%～1.12%，重復性和準確性高，與平行檢測RT-PCR方法檢測結果一致，且具有比普通RT-PCR更高的敏感性。因此，本試驗建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法在定性、定量方面均具有良好的實用性，不僅可用于不同地方不同RHDV毒株的實驗室快速檢測診斷，也可用于RHDV不同組織中定量檢測和致病機制的相關研究中。

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(責任編輯盧福莊)

Establishment and application of SYBR Green Ⅰ real-time PCR for detection of rabbit hemorrhagic disease virus

WANG Bo，LI Gui-li，WANG Yin，YAO Xue-ping，YANG Ze-xiao*

(College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China )

Rabbit hemorrhagic disease is a highly contagious disease which causes serious damage to the healthy development of rabbit keeping.In order to establish a quick，efficient and sensitive detection method，a pair of specific primers were designed for PCR amplification to obtain 979 bp sequence of rabbit hemorrhagic disease virus(RHDV) VP60 gene.Then cloned it into pMD19-T vector to construct recombinant plasmid named pMD-19T-VP60，which was served as template to establish the standard curve.Meanwhile，a pair of degenerate primer was designed in the amplification region to establish the SYBR Green Ⅰ real-time PCR detection method，and the reaction condition was optimized，and the sensitivity，specificity and reproducibility were tested.The results showed that the SYBR Green Ⅰ real-time PCR could specifically detect RHDV that the limited detection content was 8.18×101copies and no amplification of pGM19-T-EBHSV，Pasteurella multocida，Salmonella，Escherichina coli and healthy organs from rabbits.At the same time，this method was used to detect the internal organs of artificial infection rabbits.The results showed that the SYBR Green Ⅰ fluorescence quantitative PCR could quickly detect the content of the virus RNA in different organs.So this assay could be applied in clinical diagnosis of RHDV.

rabbit hemorrhagic disease virus(RHDV);VP60;SYBR Green Ⅰ;real-time quantitative PCR

浙江農業學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):400-405http://www.zjnyxb.cn

王波，李桂黎，王印，等.兔出血癥病毒SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用[J].浙江農業學報，2016，28(3):400-405.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.07

2015-11-04

國家自然科學基金資助項目(3140222)；四川省教育廳青年基金資助項目(11ZB064)

王波(1990—)，女，四川邛崍人，碩士研究生，研究方向為預防獸醫學。E-mail：18728156822@163.com

，楊澤曉，E-mail：yzxyang2003@126.com

S852.65+9.6

A

1004-1524(2016)03-0400-06