水稻DNA多態標記的開發與驗證

邱振楠，徐乾坤，王小琦，趙　娟，赫　磊，張　森，馬伯軍，錢　前，朱　麗,*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2.中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室，浙江 杭州310006)

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水稻DNA多態標記的開發與驗證

邱振楠1,2，徐乾坤1，王小琦2，趙娟2，赫磊2，張森2，馬伯軍1，錢前2，朱麗2,*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2.中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室，浙江 杭州310006)

利用203對分子標記對3個粳稻品種(日本晴、中花11、武運粳7號)和4個秈稻品種(9311、明恢63、臺中1號及南京6號)進行多態性分析，篩選到92對在秈粳間存在差異的標記、34對粳稻品種間存在差異的標記及80對在秈稻品種間存在差異的標記。對部分在多個品種中存在多態性的標記進行測序，結果表明：大部分微衛星標記在不同品種間產物的大小差異是由重復序列重復次數的多少引起，而插入/缺失標記在品種間的序列差異則各有不同，如部分非重復序列的一次或多次重復、長片段的插入或缺失等。這些多態性好、擴增穩定的分子標記的開發和多態性驗證為分子標記在種質鑒定、進化分析、遺傳多樣性檢測、分子標記輔助選育等方面的廣泛使用奠定了基礎。

水稻；分子標記；多態性；品種鑒定

自20世紀70年代DNA水平的多態性鑒定技術問世以來，越來越多的分子標記被不斷開發和利用[1-6]。水稻全基因組序列的公布及重要品種重測序計劃的陸續啟動和完成，更是極大的豐富了人們對水稻序列多態性的認識和了解，拓展了其應用領域及空間[7-11]。高密度的分子標記不僅是基因定位和克隆的基礎，而且還可以在種質鑒定、進化分析、遺傳多樣性檢測、分子標記輔助選育等方面發揮作用[12-16]，已有的研究表明，6對簡單序列長度多態性(simple sequence length polymorphism，SSLP)引物即可區分71個不同的品種[17]。李小湘等[18]用24對簡單重復序列標記(simple sequence repeats，SSR)對136份湖南地方稻進行遺傳差異分析，結果表明，SSR標記遺傳相似性系數可以部分代表表型性狀遺傳距離，但僅使用24對SSR標記進行差異性分析，標記多態性不足，對遺傳差異的分析還不夠全面。

到目前為止，從DNA序列層面上已經獲得了數量龐大的多態標記，但這些標記在不同水稻品種間的多態性驗證并不多見，高通量測序雖然可以快速、精確地分析品種間的多態性，但對大量品種進行高通量測序，在成本方面顯然不具操作性。用PCR的方法篩選更多穩定可靠的分子標記用于品種鑒定、親緣關系分析及不同群體的基因定位和克隆則更加簡便易行[19-21]。本研究利用203對分子標記，其中184對為新開發的分子標記，對3個粳稻品種及4個秈稻品種進行多態性分析，并對部分在多個品種中存在多態性的標記進行測序分析，篩選到一批多態性好、擴增穩定的分子標記，這些標記的開發和多態性驗證不僅可為分子標記輔助育種提供更多有效的標記資源，還可廣泛應用于種質鑒定、進化分析、遺傳多樣性檢測等領域。

1　材料與方法

1.1材料

選用的研究材料分別為水稻品種日本晴(NIP，粳稻)，中花11(ZH11，粳稻)，武運粳7號(WY7，粳稻)，9311(秈稻)，明恢63(MH63秈稻)，臺中1號(TN1，秈稻)，南京6號(NJ6，秈稻)，均為本實驗室保存，全部材料的種植地均為浙江富陽。其中NIP和9311為已測序品種，用于驗證多態性的正確性。ZH11，WY7，MH63，TN1及NJ6均為生產中常用的水稻品種。203對分子標記中184對為新開發的標記，19對為已有的RM標記[22]，所有的標記及對應的測序引物合成均由英濰捷基(上海)貿易有限公司完成。

1.2方法

1.2.1水稻基因組DNA提取

按照盧揚江等[23]報道的方法提取水稻基因組DNA。

1.2.2引物設計及PCR檢測

根據NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及Gramene (http://www.gramene.org/genome browser/index.html) 上的水稻全基因組信息，Blast分析日本晴和9311間序列的差別，并近似認為這些差別在待測的7個品種間也存在，利用這些差異借助生物軟件Primer Premier 5.0和DNAMAN設計引物，在7個品種間篩選有多態性的標記，分析不同品種間多態性。15 μL PCR反應體系：20 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1(NH4)2SO4，10 mmol·L-1KCl，2 mmol·L-1MgCl2，1% Triton X-100，pH 8.8，10.0 nkat Taq酶，0.17 mmol·L-1dNTPs，0.33 μmol·L-1引物，100 ng模板DNA。在Applied Biosystems 9700 PCR儀上進行擴增，反應條件為94℃ 4 min；94℃ 30s，退火(退火溫度隨引物各異)30 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 10 min。擴增產物在4%瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察。

1.2.3多態性序列分析

將篩選獲得的在多個品種間均有多態的標記，重新設計測序引物，PCR擴增對應多態品種，產物回收后由上海桑尼生物科技有限公司完成測序。用DNASTAR中的SeqMan軟件分析序列多態性。多態標記的設計基于NCBI中提供的秈稻和粳稻測序數據比對完成。在水稻數據庫Gramene中對標記的旁鄰序列進行Blast分析(http://blast.gramene.org/Multi/blastview)。

2　結果與分析

利用203對SSR標記、插入/缺失標記(insertion/deletion，InDels)及序列標簽位點(sequence-tagged site，STS)標記在7個品種間進行多態性篩選，其中184對為新開發標記，19對為RM引物。所有標記中有9對在7個品種中均無多態。在全部可正常擴增而且在不同材料中有多態的194對標記中，只在秈粳間存在差異的標記有92對(圖1，表1為部分結果)，粳稻品種間存在差異的標記有34對(圖2，表2為部分結果)，秈稻品種間存在差異的標記有80對(圖3，表3為部分結果)。

部分標記在粳稻間存在差異，可區分不同品種的粳稻，如標記ZB1-1，ZB2-26，ZB2-11，ZB3-13等在武運粳7號的帶型與日本晴和中花11不同；ZB2-15，ZB7-1，ZB7-2和KS9-24等可特異地區分中花11，其帶型與日本晴和武運粳7號不同；ZB10-2，ZB10-6，ZB11-13和ZB11-15等可特異地區分日本晴，其帶型與中花11和武運粳7號不同(圖2，表2為部分結果)。

部分標記在秈稻間存在差異，可區分不同品種的秈稻品種，如標記ZB2-15，ZB4-5，ZB4-6，ZB6-3，KS7-25等可特異區分9311與其他3個秈稻品種；ZJ8-7，ZB2-26，ZB2-11，ZB3-2，ZB8-4等可特異區分明恢63；ZB1-11，ZB1-7，ZB2-10，ZB9-4，ZB7-3，ZB7-4等可特異區分臺中1號；ZB2-25，ZB8-11，ZB9-8，ZJ8-3和ZB12-4等可特異區分南京6號；此外，還有一些標記可區分兩種秈稻品種，如ZB1-2在明恢63、南京6號中的帶型與在9311和臺中1號的帶型不同；ZB2-24在9311和南京6號中的帶型與在明恢63和臺中1號的帶型不同(圖3，表3為部分結果)。

圖1　部分只在秈粳稻間存在差異的標記Fig.1　Several markers showed polymorphism among indica and japonica rice

為了進一步明確標記在不同品種中序列的差異，對部分標記進行測序驗證，結果顯示,大部分微衛星標記在不同品種間產物的大小差異由重復序列重復次數的多少引起，而插入/缺失標記品種間序列差異則各有不同，如部分非重復序列的一次或多次重復、長片段的插入或缺失等(圖4)。對203對標記多態位點的旁鄰序列進行分析，結果表明，91.7%的標記多態性發生在基因的非編碼區或尚未被預測功能的區段內，其中發生在尚未被預測功能的區段的有52.9%，基因內含子、5’UTR、ATG前面的外顯子及TAG(TAA，TGA)后面的外顯子的有38.9%，只有8.3%的多態位點發生在基因編碼區(表4)。

圖2　部分粳稻間多態標記的PCR檢測結果Fig.2　PCR results of several markers polymorphism among japonica rice

表1部分在秈粳間存在差異的標記序列

Table 1Sequences of several markers polymorphism among indica and japonica rice

標記名稱水稻品種NIPZH11WY79311MH63TN1NJ6序列信息5'-3'RM編號ZB1-10aaabbbbCTACCCCTAAGAGCCGCATCCGGCGCCTCCATCATCAGCAGGTZB1-9aaabbbbTAGCTCCAACAGGATCGACCGTACGTAAACGCGGAAGGTGRM493ZB1-3aaabbbbGGGTCATATTTCTATTAATTCAAGGAAAATCCACCACTAATCZB2-1aaabbbbATATGCAAGGATGAAATCAATCTCCACCTCGGCAGGTATAZB2-3aaabbbbAGGAGCGTGCTGCGTGCGG-GATCCGCCACCACGCCCGACCTTTTZB2-4aaabbbbTTGTGTTGTAATCTATCTT-GTTTTTGGATTTGGTGAAAACTTAACACZB2-14aaabbbbGTTGATAGATTGCATTGCCAACAAAGCTAGAAGTGTTAACCT-GTAAZB2-17aaabbbbCCTCCACTTCCAAAATAAATGTTTGAATGTTCAAAATTAGCAACZB2-19aaabbbbCGGATTGGCGAGGGGATAGGGGACGGAAAAGGGAGCGAAAAZB3-9aaabbbbTCCAGTCCACTAAAAGTTTTCATTATGCTATAGGCTTTGAGCZB3-12aaabbbbTACTCCTATCCTGCCATGGCTGTAGTAGACGAGAGGCCGGRM3513ZB3-7aaabbbbGGTGATGCAGGTGCTAGAAG-GCGATCAGATGCGCGTTCCTGGCCATZB3-8aaabbbbGAGTTACCTCCATCCTGTTGCAGAGTCTTGATCTCGTGCTTCZB4-15aaabbbbATGGCCAGCGTGATCTCCCCACCGAATCGAATAACCACRM6089

注：“a”“b”用于區分不同的帶型。

表2部分粳稻間多態性標記序列

Table 2Sequences of several markers polymorphism among japonica rice

標記名稱水稻品種NIPZH11WY7染色體序列信息5'-3'RM編號ZB10-2abb10TCCATCAAGTTTGAAGGTAACTGTACTAGTGAATGTTGCATGZB10-6abb10CTCTCAAAGAACTAGGACTCGAGAAGGTATGATAACCAATRM4455ZB11-13abc11AATAAGGGAGAGCCAATCTGTAGTAGATGGCCGTTCTCTCRM2191ZB11-15abb11ATGTTTGAGAAAATGCAGACCACTAAGCTCGTTTTCAAAGRM2136ZJ8-7abb3CCGCTTCGAGACGACGCTGAGAGCCCGAATCCCCAAAACCCTZB2-15aba2TTGCCTTCTTTACTAGCATATCCCATACTACTGAGAATGGGTTGZB7-1aba7TTTACAACCAACGGTTCGATGAAACTTAGATTTGCCCTTCAAZB7-2aba7GCCGGGCAGGATCTCGAAGCGTAAACGGGCTGGACGGACTGKS9-24aba1CCATTTATTGTGATAATTTGCTACTTGCGTTCATCTGGACZB1-1aab1GATTTGGAAATCAACCATTACCACCCACATTGTTTGTTAGATZB1-6aab1ATGAAAAGGTAAATGATGACGCAATGCATACTGCTTTATTTCZB2-16aab2TGAGATTTACTTCTGAGACCAC-CACGACGCAGCCGCCACAAAACCCT

續表2

注：“a”“b”“c”分別表示不同的帶型。下表同。

表3部分秈稻間多態性標記序列

Table 3Sequences of several markers polymorphism among indica rice

標記名稱水稻品種9311MH63TN1NJ6染色體序列信息5'-3'RM編號ZB2-15abbb2TTGCCTTCTTTACTAGCATATCCCATACTACTGAGAATGGGTTGZB4-5abcc4GGTGATGATCAGGTGATCCATTACTGCATACGACTTACGAGCZB4-6abbb4CAGTGTTGACCTTTTGAACTAATCAAATATCAAGCCACTCCTTTZB6-3abbb6CACGACTCCACCAACCCCAGCGACGTCGTCGAGATGCGTTGCKS7-25abbb2TATAGTCCGTGAATAATGGTGATATTACAGACAGATAAAGGA-GAZJ8-7abaa3CCGCTTCGAGACGACGCTGAGAGCCCGAATCCCCAAAACCCTZB2-26abaa2CACTCAAGACCAGACCTGTACGCGGCACGTCATTGTAGTGACRM5472ZB2-11abaa2CCCCACAGTGCTGACGCCTCTCGTTGCGCTAGCTCGGATTCGZB3-2abaa3TGTTGTTTTGGAGATTTGAAGGGAGGCGAAAAGTCACGTAAGCZB8-4abaa8TAGCGGGCTGACTTCTAGTTGACTGCACTATAAATCTTCAGT-TCC

續表3

3　結論與討論

水稻經過長期的自然演化和人工選擇產生了豐富多樣并各具特色的種質資源，為高產、優質、抗逆等新品種培育提供了重要的遺傳基礎。傳統的表型分析受自然環境、栽培方式等條件的影響，無法穩定、準確地判斷種質遺傳背景。分子標記以DNA為模板，不受外界環境影響，判斷的穩定性和準確性可大幅提高[15-17]。但是少量的多態標記很難細致區分不同品種間高度同源的序列，因此發掘更多的分子標記，盡可能多地體現不同品種間的多態性，有著非常重要的意義，表型分析與多個分子標記輔助鑒定相結合，將會使不同稻種資源遺傳相似性鑒定更為準確、細致[18-21]。雖然水稻全基因組測序工作已經完成，但對于非測序品種來說也只能提供序列參考，與重測序技術高昂的成本相比，用現有序列提供的信息，通過PCR技術發掘并驗證更多的多態性分子標記則更為簡便易行。本研究通過發掘和驗證新的分子標記在3個粳稻品種和4個秈稻品種間的多態性，篩選到92對在秈粳間存在差異的標記，34對粳稻品種間存在差異的標記及80對在秈稻品種間存在差異的標記。除了本研究中選用的7個水稻材料，通過篩選更多的品種，可使這些新開發的標記廣泛應用于種質鑒定、進化分析、遺傳多樣性檢測、分子標記輔助選育等領域，應用前景廣闊。

表4多態位點位于基因編碼區的標記及對應基因

Table 4Markers polymorphism in the coding region and the corresponding genes

編號多態位置基因功能注釋ZB9-9LOC_Os09g24480.1:exon_1TCP家族轉錄因子10-5LOC_Os10g31864.1:exon_50表達蛋白A10-7LOC_Os10g41670.1:exon_3表達蛋白11-4LOC_Os11g14380.1:exon_2抗性蛋白LR10ZB11-10LOC_Os11g41430.1:exon_3逆轉座子蛋白ZB12-6LOC_Os12g36310.1:exon_5表達蛋白A12-7LOC_Os12g39020.1:exon_2BED鋅指結構蛋白KS7-8LOC_Os02g01470.1:exon_1逆轉座子蛋白KS7-16LOC_Os02g06060.1:exon_1假設蛋白KS9-10LOC_Os01g70890.1:exon_1組蛋白類似轉錄因子KS9-13LOC_Os01g72210.1:exon_9脫水早期反應蛋白KS9-15LOC_Os01g72650.1:exon_4RNA識別基序蛋白KS9-18LOC_Os10g37540.1:exon_1OsFBDUF48-F盒DUF結構域蛋白KS9-25LOC_Os10g34440.1:exon_2表達蛋白KS9-26LOC_Os10g35040.1:exon_2受體激酶蛋白KS9-27LOC_Os10g35120.1:exon_1表達蛋白KS9-28LOC_Os10g35330.1:exon_1表達蛋白

圖4　部分品種間多態性標記的測序結果Fig.4　Sequencing validations of several markers polymorphism among several rice cultivars

在全部可正常擴增而且在不同材料中有多態的194對標記中，在秈粳間、粳稻品種間及秈稻品種間存在差異的標記有206對，超過了194對的標記總數，這是由于部分標記在秈稻和粳稻中各自存在差異，為了便于分類使用，在統計過程中重復統計所致，如圖5中的ZB9-4，ZB9-8，ZB6-5等，在粳稻間、秈稻間各自存在差異。為了驗證多態的正確性，對一些標記進行測序，結果表明，部分在電泳圖中表現出的微弱差別，可能是由于電泳條件的影響，如KS7-4在電泳圖中NIP比MH63產物略大，而測序結果卻表明二者在序列上沒有差異；同樣8-8在電泳圖中各個品種的產物大小順序為WY7>NIP=9311>ZH11=MH63，測序結果卻表明，WY7與NIP的產物大小一樣，均比9311多了6個堿基，相鄰的泳道更容易區分產物的大小差異(圖4)。一些標記在不同品種間的差異非常大，如3-5在9311和NIP之間有16個堿基的差異，但在NIP和WY7之間有266個堿基的差異，這種類型的標記在NCBI比對同源序列的過程中通常會被自動打斷，因此在設計分子標記時考慮兩段比對序列接頭處的多態，往往也能獲得多態性非常好的標記。通過測序還發現，部分序列在非常鄰近的序列有多個多態位點，如ZB5-2在9311和NIP之間，多態位點附近600 bp的序列中有2個穩定的序列插入和缺失差異；ZB6-3多態位點附近的序列在NIP，9311和NJ6之間出現了多處插入缺失變異及SNP變異(圖4)，這些序列可能是水稻進化過程中變異頻率比較高的位置，可用于區分多個品種間的差異。

不同水稻品種間農藝性狀的差異，本質上是由基因變異所致，因此利用DNA分子標記鑒定不同品種的基因型，可為指導雜交親本選配、開展秈粳稻亞種間雜種優勢的利用、優質抗病等定向遺傳改良等方面提供參考。此外，分子標記輔助育種將基因型鑒定和表型鑒定相結合，提高了水稻育種的目的性和中間材料的篩選效率，在生產上具有非常重要的應用價值。近年來的研究結果表明，現有的分子標記在秈粳稻亞種間多態性較好，但在亞種內多態性較低[18，24-25]。王林友等[24]用19對InDel標記對48個秈稻、粳稻及中間型材料進行秈粳屬性分析后發現，由于亞種內品種遺傳相似性較高，僅用19對標記進行分析會造成不同品種的誤判概率升高，需要開發更多更準確的標記才能精確區分亞種內的差別。本研究新開發的標記中有34對標記可用于區分粳稻亞種間的差別，80對標記可用于區分秈稻亞種間的區別，用這些標記對更多亞種進行多態性分析，可大幅提高亞種內品種的辨識率，為分子標記的在新品種選育方面的廣泛使用提供參考。

圖5　不同品種間部分多態標記的PCR檢測結果Fig.5　PCR results of several polymorphism markers in different cultivars

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(責任編輯侯春曉)

The development and verification of nucleotide polymorphism markers in rice

QIU Zhen-nan1，2，XU Qian-kun1，WANG Xiao-qi2，ZHAO Juan2，HE Lei2，ZHANG Sen2，MA Bo-jun1，QIAN Qian2，ZHU Li2,*

(1.College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China;2.State Key Laboratory of Rice Biology，China National Rice Research Institute，Hangzhou 310006，China)

In this work，polymorphic analysis among 3 japonica cultivars (NIP，ZH11 and WY7) and 4 indica cultivars (9311，MH63，TN1 and NJ6) were conducted with 203 molecular markers，92 polymorphism markers between japonica cultivars and indica cultivars，34 polymorphism markers in japonica cultivars and 80 polymorphism markers in indica cultivars had been screened.Sequencing analysis results showed that the polymorphism of microsatellite markers among different varieties was mainly caused by the different repetitions of repetitive sequence.However，the polymorphism of insertion/deletion marks was determined by the repetition times of non-simple repetitive sequence and insertion or deletion of long fragment.Besides the development of new markers，several RM markers also had been verified whether possessed polymorphism in different varieties.Taken together，these new polymorphism markers were bound to be of great service to use in germplasm identification，evolution，genetic diversity detection and molecular marker-assisted selection.

rice;molecular markers;polymorphism;cultivar identification

浙江農業學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):361-370http://www.zjnyxb.cn

邱振楠，徐乾坤，王小琦，等.水稻DNA多態標記的開發與驗證[J].浙江農業學報，2016，28(3):361-370.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.01

2015-08-10

國家自然科學基金面上項目(31171532)；浙江省“轉基因農作物新品種培育”科技創新團隊項目(2011R50021)；中央級公益性科研院所專項資金項目(2015RG001-2)

邱振楠(1989—)，男，山東德州人，碩士研究生，研究方向為水稻遺傳育種。E-mail:zhnanqiu@126.com

，朱麗，E-mail:zhuli05@caas.cn

S511

A

1004-1524(2016)03-0361-10