新生大鼠海馬神經干細胞的分離培養及分化研究

苗宗寧，吳衛江，錢寒光，趙基棟

（江蘇無錫市第三人民醫院，江蘇 無錫214041）

1 引 言

神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是一類起源于神經外胚層，具有自我更新能力并在一定條件下分化為神經元和膠質細胞的多潛能干細胞［1-3］。胚胎期和成人中樞神經系統均發現有神經干細胞，其存在于特殊的niches中，通過自分泌或旁分泌的方式可以產生多種神經細胞因子，神經遞質等特異性的功能蛋白［4-5］。研究表明移植NSCs可有效地修復損傷的脊髓組織，重建神經間的連接，治療脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）［6-9］。NSCs主要存在于哺乳動物側腦室的室管膜下區和海馬的齒狀回顆粒下層以及脊髓中央管室管膜區等［10］。本實驗采用無血清培養法進行新生大鼠海馬NSCs體外分離培養，觀察其在體外增殖、分化等一系列細胞形態學變化，為細胞移植治療SCI提供有效的細胞來源。

2 材料與方法

2.1 實驗動物

新生SD大鼠，由江蘇省血吸蟲病防治研究所提供，許可證號SCXK（蘇）2007-0021。

實驗試劑及材料：DMEM/F12培養基，胎牛血清，Penicillin-Streptomycin，StemPro Accutase（Gibco）；B-27（Invitrogen）；表皮生長因子，堿性成纖維細胞生長因子（Pepro Tech）；兔抗大鼠nestin單克隆抗體，兔抗大鼠GFAP單克隆抗體，兔抗大鼠NSE多克隆抗體，FITC標記的山羊抗兔Ig G（abcam）；DAPI，多聚賴氨酸（Sigma）；IX-71熒光顯微鏡（O-lympus）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus）；培養瓶，離心管，移液管（Corning）；sABC試劑盒（BOSTER）；CO2細胞培養箱（Thermo）。

2.2 方法

2.2.1 新生大鼠海馬神經干細胞分離培養及鑒定 取新生SD大鼠（出生24 h以內），頸椎脫臼法處死，碘酒浸泡1 min后75%乙醇漂洗3次×2 min/次。剪開頭皮及顱骨，在解剖顯微鏡下，分離出海馬區腦組織。用顯微鑷剝除腦膜及血塊并用預冷的D-Hank’s液漂洗2次，用眼科剪剪碎，Accutase蛋白酶37℃消化3 min，用彎頭滴管輕柔吹打，制成單細胞懸液，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液收集沉淀細胞，加入3 ml完全培養基（DMEM/F-12+2%B-27+1%Penicillin-Streptomycin+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF），混勻后接種于12.5 cm2培養瓶，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜置培養，第三天開始每3天更換培養液1次，2周左右傳代1次。

換液時將培養瓶中培養液輕輕混勻后移至離心管，800 r/min離心3 min，吸出一半上清液，加入一半37℃預溫的完全培養基，混勻后接種至培養瓶。

傳代時將培養瓶中培養液輕輕混勻后移至離心管，1 000 r/min離心3 min，吸出上清液，加入 Accutase蛋白酶37℃消化3 min，加入5 ml完全培養基，用彎頭滴管輕柔吹打，800 r/min離心3 min，棄去上清液收集沉淀細胞，加入完全培養基，按照1∶3的比例傳代培養。

鑒定時無菌條件下取多聚賴氨酸包被的蓋玻片，置于6孔板內，收集第三代NSCs，接種到蓋玻片上，培養3天后，取出蓋玻片，D-Hank’s液漂洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次后山羊血清封閉20 min，棄血清加入兔抗大鼠nestin單克隆抗體（1∶1000），37℃孵育 2 h，PBS漂洗 3次后加入FITC標記的山羊抗兔 Ig G（1∶1 000），37℃避光反應30 min，PBS漂洗后熒光顯微鏡下觀察。

2.2.2 新生大鼠海馬神經干細胞誘導分化及鑒定 無菌條件下取多聚賴氨酸包被的蓋玻片，置于6孔板內，收集第三代 NSCs，應用誘導培養基（DMEM/F-12+10%FBS+2%B-27+1%Penicillin-Streptomycin+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF）接種到蓋玻片上，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。培養7天后，取出蓋玻片，D-Hank’s液漂洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次后山羊血清封閉20 min，棄血清，分別加入兔抗大鼠GFAP單克隆抗體（1∶500）和兔抗大鼠NSE多克隆抗體（1∶500），37℃孵育 2 h，PBS漂洗 3次后加入FITC標記的山羊抗兔 Ig G（1∶1 000），37℃避光反應30 min，PBS漂洗后加入終濃度為100 ng/ml DAPI溶液避光狀態下行細胞核染色5 min，PBS漂洗后熒光顯微鏡下觀察。

3 結果

3.1 新生大鼠海馬神經干細胞分離培養及鑒定

從海馬組織分離的細胞原代接種后，在顯微鏡下觀察可見細小組織團塊以及單個細胞，細胞懸浮生長，多呈圓形，大小不一，折光性強。接種2～3天后，可見細胞碎片增多，部分細胞貼壁，隨著時間的推移，懸浮細胞集聚成小細胞團，逐漸長成由細胞組成的桑葚狀細胞球，部分細胞球因體積過大出現細胞球中心顏色暗淡、透光性較差。體外傳代培養后，死亡細胞以及組織碎片減少，可見典型神經球形成，免疫熒光染色結果顯示神經球中有大量nestin陽性細胞存在，見圖1。

圖1 新生大鼠海馬神經干細胞分離培養及鑒定。A.原代培養3天 ×40；B.原代培養10天 ×100；C.傳代培養7天 ×200；D.E NSCs免疫熒光染色顯示nestin陽性細胞 ×100。Fig 1 Isolation culture and identification of the newborn rat hippocampal neural stem cells.A.The morphology of primary generation cells at 3 days×40；B.The morphology of primary generation cells at 10 days×100；C.The morphology of subculture cells at 7 days×200；D-E.NSCs immunofluorescence staining show nestin positive cells×100.

3.2 新生大鼠海馬神經干細胞誘導分化及鑒定

用含血清培養基培養NSCs后，顯微鏡下可見NSCs球很快貼壁，24 h后大量貼壁生長細胞從NSCs球周圍長出。開始階段由于細胞密度大，以NSCs球為中心向四周放射狀成片生長，隨著培養時間的延長，邊緣部位細胞突起逐漸變長、增多，與相鄰的細胞構成網狀結構，細胞中既有具有多個長突起的神經膠質樣細胞，也有具有短突起的神經元樣細胞，見圖2。免疫熒光染色結果可見大量GFAP陽性細胞及NSE陽性細胞，見圖3。

圖2 NSCs誘導分化后細胞形態變化A.分化3天 ×40；B.分化7天 ×40；C.分化10天 ×100；D.分化14天 ×100。Fig 2 The cell morphological changes after NSCs differentiation at day 3，7，10 and 14

圖3 NSCs誘導分化后免疫熒光染色GFAP和NSE表達。Bar=100μmFig 3 The expression of NSE and GFAP identify by immunofluorescence staining after NSCs differentiation.Bar=100μm

4 討論

神經干細胞是一類原始的未分化的多潛能干細胞，具有自我更新能力，主要向神經系統方向分化，如神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等，存在于海馬齒狀回和室管膜下區等區域［11-12］，在SCI治療的相關研究中，NSCs移植受到廣泛關注，此類方法多是通過促進移植到SCI部位的外源性NSCs有效地向神經元分化，促進脊髓重建及神經修復的作用［13-14］。因此，獲取大量NSCs并建立穩定的分離培養方法尤為重要。本實驗從新生大鼠海馬組織分離并培養了NSCs，體外可以增殖，通過條件培養基可以誘導分化為神經元和神經膠質細胞，為進一步研究NSCs體內移植后的分化和NSCs治療SCI提供了前期的技術支持。

研究表明不同部位來源的中腦神經干細胞具有不同的生物學特性，即具有“區域特異性”［14］。本實驗對新生小鼠海馬神經干細胞進行了分離培養，由于新生小鼠海馬組織體積非常小，因此，建立適合的分離培養方法就很重要。神經干細胞原代分離主要采用酶消化法和機械吹打法，研究表明酶消化過程和機械打散都對細胞的活性造成不利影響，常見的胰蛋白酶通過水解細胞間的蛋白質使細胞分離，但其消化能力較強，容易造成細胞膜上的蛋白質也被消化，進而釋放其核內的DNA，而這些DNA具有很強的黏性，會將分離消化的單細胞黏附在一起，從而引起細胞的損傷和死亡。機械吹打可以避免細胞膜被消化，但不易掌握吹打的次數和力度，可造成細胞膜的機械損傷，導致細胞活性下降及死亡［15］。這說明需要改進消化過程，例如換用消化能力更加溫和的酶，并且減少吸管吹打。研究發現accutase消化酶通過化學解離的方法來分散組織，在細胞培養中的損傷作用具有非特異性［16］。本實驗中采用accutase來分散海馬組織和神經球進行原代和傳代分離培養，并輔以輕微的機械吹打，盡可能減少對細胞的損傷。由于海馬組織體積很小，分離后不通過濾網過濾而直接培養，死亡細胞以及組織碎片通過更換培養液以及液化作用可以緩慢去除，這樣可以盡可能保留存活細胞。

目前主要通過懸浮培養法體外培養NSCs，這是保持NSCs干性的重要條件［17-18］。EGF主要是維持干細胞的長期存活生長，可以促進NSCs進行對稱性分裂，產生的子代細胞均可繼續分裂。B-27、bFGF則起到維持細胞懸浮、抑制神經干細胞分化的作用，bFGF還可促進NSCs進行非對稱性分裂，所產生的子代細胞中只有一個細胞能夠繼續分裂。bFGF與EGF同時應用，bFGF可以顯著加強EGF的作用［19-21］。本實驗以 DMEM/F12為基礎培養基，輔以B27添加劑，同時加入bFGF及EGF構成完全培養基，成功培養出NSCs，并進行了有效地增殖和分化。

Nestin是一種中間絲蛋白成分，屬于第Ⅵ類中間絲蛋白，僅在胚胎早期神經上皮表達，當神經前體細胞向終末方向分化為神經元和膠質細胞時，Nestin便停止表達，故最常用來鑒定 NSCs［22］。NSE和GFAP均為一種胞漿蛋白，NSE主要表達于神經元。GFAP屬Ⅲ型中間絲蛋白家族成員，在活化的星型膠質細胞中大量特異性表達［23］。實驗中培養的神經球經免疫熒光染色可見大量Nestin陽性細胞存在，表明成功培養出未分化的NSCs。神經球用體積分數為10%胎牛血清的培養基培養后，可見神經球貼壁后向四周延伸出多個突起，逐步形成相互連接，交錯成網，NSE和GFAP染色顯示陽性，說明神經干細胞在一定條件下可以分化為神經元和星形膠質細胞。實驗選取新生大鼠海馬組織進行體外分離培養，盡管優化了取材方法，仍無法避免雜細胞，因此取材與培養方法需要進一步改進，從而快速、精確的獲取NSCs。