EYFP基因導入大豆根瘤菌工程菌株的構建

張先成，甄濤，于盛竹，曲娟娟，于德水

（1.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱150010；2.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱150030）

EYFP基因導入大豆根瘤菌工程菌株的構建

張先成1，甄濤1，于盛竹2，曲娟娟2，于德水1

（1.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱150010；2.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱150030）

將黃色熒光蛋白基因（EYFP）整合到質粒pBBR1MCS-2上，構建pBBR1MCS-2-EYFP，通過三親本雜交的方法，將構建的載體轉化到HW-05中，獲得含有黃色熒光蛋白的根瘤菌菌株。

熒光蛋白基因；大豆根瘤菌；三親本雜交

20世紀以來，分子生物學技術高速發展，隨著標記基因的出現，通過基因標記評價根瘤菌的競爭結瘤能力更為快捷和準確。目前，廣泛應用的標記基因有發光酶基因、紅色熒光蛋白基因和綠色熒光蛋白基因。黃色熒光蛋白基因（Enhanced Yellow Fluorescent Protein gene，EYFP）是GFP增強型熒光基因，廣泛應用于動植物和微生物的標記研究。通過本項研究，將熒光蛋白基因導入與我省主栽大豆品種匹配度較高的，為深入研究根瘤菌在土壤和作物根部定殖研究以及根瘤菌的固氮機制做了鋪墊性預研工作，為更加充分揭示根瘤菌固氮機理研究做了基礎性工作。

1　材料與方法

1.1供試菌株和質粒

慢生型大豆根瘤菌HW-05（Bradyrhizobium japonicum）為本研究室分離并保存的慢生型大豆根瘤菌。大腸桿菌（E.coli）DH5α為本實驗室保存。質粒pBBR1MCS-2（KmR）和pRK2013（KmR）均由西班牙塞維利亞大學生物系Jose教授惠贈。

1.2PCR擴增引物

表1　引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3各種酶制劑及試劑盒

實驗中所使用的各種限制性核酸內切酶、DNA聚合酶、T4DNA連接酶等購自Promega、TaKaRa、NEB等生物工程公司；PlasmidminiKit（50）購自OMEGA公司；DNA Purification Kit（50）購自OMEGA公司。

1.4培養基

LB培養基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL。

TY培養基：酵母粉3g，胰蛋白胨5g，CaCl20.87g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL。

2　試驗方法

2.1EYFP基因的克隆

利用EYFP基因和pBBR1MCS-2載體共有的HindⅢ和BamHⅠ兩種內切酶進行酶切，回收EYFP產物與pBBR1MCS-2進行連接并轉化至E.coli DH5α。送予上海生物工程有限公司進行測序。

2.2HW-05重組子的篩選與鑒定

以構建的突變株菌液為模板，分別以EYFP（F）和EYFP（R）為引物，驗證HW-05重組子染色體上是否外源基因EYFP。

3　結果與分析

3.1重組載體pBBR1MCS-2-EYFP的構建結果

利用EYFP基因和pBBR1MCS-2載體共有的HindⅢ和BamHⅠ兩種內切酶進行酶切，酶切后連接，結果如圖1所示，出現一條特異性條帶，其大小約為5.9kb左右，再經酶切驗證后可以初步確定EYFP基因已經正確的插入到pBBR1MCS-2載體上。

圖1　EYFP與pBBR1MCS-2轉化后提取結果M：DNAMarker DL10000 1:EYFP/pBBR1MCS-2連接后轉化提取結果Fig.1 The resultof EYFP/pBBR1MCS-2 transform ationM:DNAMarker DL10000 1:EYFP/pBBR1MCS-2 extraction result

3.2基因工程菌株的構建結果

利用PCR擴增EYFP基因，結果如圖2所示，條帶一條特異性條帶，其大小約為700bp左右，說明EYFP基因存在于基因組之中。

圖2　重組子篩選M：DNAMarker DL100001:HW-05中EYFP基因PCR擴增產物Fig.2 Screen the candidate M:DNAMarker DL100001-:PCR am plication resulto f EYFP gene in HW-05

4　結語

我省是全球野生大豆資源豐富的地區，土壤中存在大量的土著根瘤菌群，其競爭結瘤能力強但固氮能力弱，接種根瘤菌會影響結瘤率，接種效果十分不理想，進而制約了根瘤菌菌劑在我省的推廣應用。篩選高效結瘤能力的根瘤菌迫在眉睫，經過我所多年研究，分離獲得的根瘤菌HW-05與我省主栽大豆品種具有極強的親和關系，具備發展為優良根瘤菌菌劑的潛質。隨著研究的不斷深入，科學地準確評價根瘤菌結瘤競爭能力又是根瘤菌制劑應用于實際的技術關鍵。

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Construction of EYFP gene into engineered strain of Rhizobium

ZHANG Xian-cheng1，ZHEN Tao1，YU Sheng-zhu2，QU Juan-juan2，YUDe-shui1
（1.Istitute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010 China；2.School of Resourcesand Environment，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Integrating theyellow fluorescentprotein（EYFP）intoplasmid pBBR1MCS-2 to constructpBBR1MCS-2-EYFP，and through themethod of tri-parentalhybridization，the constructed carrierwas transformed into HW-05，so as to obtain Rhizobium strains containinga yellow fluorescent protein.

Fluorescent protein gene；Soybean Rhizobium；Triparental hybridization

S144.5

A

1674-8646（2016）18-0008-02

2016-08-08

于德水（1969-），男，黑龍江哈爾濱人，研究員，從事大豆根瘤菌研究。