牛eIF5基因原核表達與蛋白純化

高學(xué)軍，臧艷麗，魏誠杰，駱超超（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省高校農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，哈爾濱150030）

牛eIF5基因原核表達與蛋白純化

高學(xué)軍，臧艷麗，魏誠杰，駱超超
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省高校農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，哈爾濱150030）

研究應(yīng)用PCR方法擴增牛eIF5基因編碼序列，通過Eco RⅠ和SalⅠ酶切位點將其定向插入pGEX-4T-1載體，構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-eIF5，并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21。酶切和測序鑒定正確后，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）大量誘導(dǎo)表達，利用GST-Sepharose 4B親和珠純化，SDS-PAGE和Western Blot鑒定。結(jié)果表明，原核表達載體pGEX-4T-1-eIF5構(gòu)建成功，Western Blot證實融合蛋白大量表達，純化后獲得GST-eIF5融合蛋白，為深入研究牛eIF5蛋白功能奠定基礎(chǔ)。

牛；eIF5；克隆；原核表達；純化

網(wǎng)絡(luò)出版時間2016-6-17 15:21:53[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160617.1521.012.htm l

高學(xué)軍,臧艷麗,魏誠杰,等.牛e IF5基因原核表達與蛋白純化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(6):68-73.

Gao Xuejun,Zang Yanli,Wei Chengjie,et al.Prokaryotic expression and protein purification of gene bovineeIF5[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):68-73.(in Chinese with English abstract)

真核生物翻譯起始因子（Eukaryotic translation initiation factor，eIF）主要有eIF1、eIF2、eIF2B、eIF3、eIF4A和eIF5等[1]。真核生物翻譯是將遺傳信息從mRNA傳遞到蛋白質(zhì)過程，包括起始、延伸和終止，大多數(shù)翻譯調(diào)節(jié)均作用于起始步驟[2-4]。Maag等研究表明，在翻譯起始過程中，核糖體復(fù)合物識別到mRNA上正確起始位點至少需要12種真核生物因子共同作用[5]。研究表明，eIF2、eIF5和eIF1在這一進程中發(fā)揮主要作用[6-8]。43S核糖體亞基由40S亞基和多重復(fù)合物（Multifactor com?plex，MFC）組成，包括eIF2-GTP-（Met-tRNAiMet）三元復(fù)合物、eIF3、eIF1、eIF1A和eIF5[9]。MFC結(jié)合40S核糖體亞基后，GTP酶催化蛋白eIF5催化eIF2上GTP水解為GDP[10-11]。當Met-tRNAiMet和mRNA上密碼子與反密碼子配對后，eIF2-GDP和無機磷酸鹽從核糖體48S亞基上釋放[12]。結(jié)果顯示，eIF5-eIF2-GDP復(fù)合物中eIF5和eIF2一起釋放后，48S核糖體亞基結(jié)合60S亞基形成80S起始復(fù)合體，蛋白質(zhì)合成延伸步驟啟動[13-16]。……