不同濃度CB2受體激動劑預處理對大鼠海馬神經元凋亡的保護作用及機制

馮婭妮,石　強

?

不同濃度CB2受體激動劑預處理對大鼠海馬神經元凋亡的保護作用及機制

馮婭妮a,石強b*

目的探討CB2受體激動劑AM1241預處理對缺氧/復氧后大鼠海馬神經元凋亡的影響。方法離體培養的大鼠海馬神經元，隨機分成6組：對照組(Con組)，細胞未做特殊處理。CoCl2組：300 μM CoCl2預處理4 h后，正常培養基繼續培養24 h，然后用無血清培養基培養。AM1241 1 μmol/L組、AM1241 3 μmol/L組、AM1241 5 μmol/L組、AM1241 10 μmol/L組：培養孔中分別加入濃度為1、3、5、10 μM AM1241處理2 h后，加入300 μM的CoCl2處理4 h，然后更換正常的培養基培養24 h，之后更換無血清的培養基培養。MTT法測定細胞增殖，RT-PCR技術檢測bcl-2、caspase-3、iNOS mRNA的表達。結果與AM1241 1 μmol/L組和AM1241 3 μmol/L比較，AM1241 5 μmol/L組和AM1241 10 μmol/L組預處理明顯增加海馬神經元的增殖能力(P<0.05或P<0.01),上調bcl-2 mRNA的表達，下調促凋亡基因caspase-3和iNOS mRNA的表達(P<0.05或P<0.01)。結論5 μM和10 μM AM1241預處理通過對凋亡相關基因的調控，對缺氧/復氧后的海馬神經元有保護作用。

CB2受體；細胞凋亡；海馬；神經元

0　引言

凋亡是腦缺血再灌注后神經細胞經典的死亡方式[1-2]。有研究表明，中樞神經系統內的內源性大麻素系統通過抗氧化抑制自由基的形成，抑制鈣內流，調節神經細胞的發育等對神經元起保護作用[3-4]。在腦外傷及腦缺血缺氧的模型中顯示出大麻素的保護作用，但確切機制目前尚不完全清楚[5]。本研究擬觀察不同濃度的CB2受體激動劑AM1241預處理后對大鼠的海馬神經細胞缺氧/復氧損傷后凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1海馬細胞的制備新生24 h的SD大鼠(由中國醫科大學實驗動物部提供)，無菌剝離大鼠全腦后，顯微鏡下分離雙側海馬組織。將海馬組織塊移入0.125%胰蛋白酶(Sigma公司，美國)的解剖液中，37 ℃消化30 min。以(4～5)×108個/min的密度將神經元接種在50 mL的無菌培養瓶中(Coster公司，美國)，5% CO2、37 ℃培養9 d，傳代密度為0.2×108個/L。

1.2分組及處理隨機分成6組：對照組(Con組)細胞不做特殊處理，CoCl2組：用300 μmol/L CoCl2處理4 h，用正常的培養基培養24 h，之后更換無血清的培養基培養。AM1241/1組、AM1241/3組、AM1241/5組、AM1241/10組：培養孔中分別加入濃度為1、3、5、10 μmol/L AM1241(此濃度由預實驗獲得)處理2 h后，加入300 μmol/L的CoCl2處理4 h，然后更換正常的培養基培養24 h，之后更換無血清的培養基培養,再測定有關指標。

1.3MTT法測AM1241對海馬神經細胞活力的影響每組36孔，每孔加0.25%MTT溶液20 μL，37 ℃、5% CO2孵育4 h，將上清去掉，每孔加入10%的二甲亞砜(DMSO)100 μL，用雙波長掃描分光光度計測定標本，在490 nm處測光吸收值(OD值)以判斷細胞活力。

1.4RT-PCR檢測bcl-2、caspase-3、iNOS的轉錄采用Trizol法提取各組神經元的RNA，分別在預處理后24 h收集細胞提取RNA，Real-time PCR引物委托TaKaRa公司合成。反轉錄過程中利用隨機引物作為反轉錄引物,將總RNA反轉錄成cDNA，以GAPDH為內對照。bcl-2引物片段長度為402 bp,上游：5′-GTCATGTGCATTTCCACGTC-3′，下游：5′-ACAAACCCCCCACACAGCAAAG-3′；caspase-3引物片段長度為363 bp,上游：5′-TGGAACAAATGGACCTGTTGACC3,下游：5′-AGGACTCAAATTCTGTTGCCACC-3’；iNOS引物片段長度為499 bp,上游：5-′CCTTGTTCAGCTACGCCTTC-3’；下游：CTGAGGGCTCTGTTGAGGTC-3’；GAPDH引物片段長度為338 bp,上游:5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。取1.5%瓊脂糖凝膠擴增，用KODAKID型凝膠成像，使用該公司的quantityOne圖像軟件對電泳條帶進行分析,以各目的帶與內參對照的比值表示mRNA的表達量。

2　結果

2.1海馬細胞活力的變化經過5、10 μmol/L AM1241預處理后，在無血清培養條件下，海馬細胞的增殖高于無預處理組(P<0.01)。見表1。

2.2bcl-2、caspase-3和iNOS mRNA轉錄的變化與AM1241/1組和AM1241/3組比較，AM1241/5和AM1241/10組預處理明顯上調bcl-2 mRNA的表達(P<0.01或P<0.05)，下調caspase-3 mRNA和iNOS mRNA的表達(P<0.05)。見表2。

表1　各組OD值的變化

注：與Con組比較，**P<0.01；與CoCl2組比較，##P<0.01

表2　各組bcl-2、iNOS、caspase-3 mRNA表達變化

注：與Con組比較，*P<0.05，**P<0.01；與CoCl2組比較，#P<0.05

3　討論

大麻素受體分為中樞型大麻受體(CB1)和外周型大麻受體(CB2)，在生理狀態下，CB2在中樞系統中的含量很低，但當神經系統受到損害時，大量的CB2受體表達增加，凋亡減少。其可能通過減少小膠質細胞的毒性因子，增加神經營養因子的釋放，從而減輕機體的炎性反應[6]。本研究通過建立細胞缺血模型，進一步研究大麻素系統對神經系統疾病的保護作用及機制。

研究神經系統缺血缺氧的模型常用動物模型，本研究用CoCl2模擬神經系統細胞水平的缺氧刺激，建立了一種簡便細胞缺氧模型。CoCl2可以誘導低氧過程的關鍵因子低氧誘導因子1-α的上調，從而調節低氧的諸多效應基因的表達變化，是比較公認的化學乏氧的模擬物[7]，我們在實驗中用300 μM CoCl2預處理海馬神經元，發現海馬神經元的增殖能力下降，凋亡水平升高。

神經元缺氧/復氧過程包括：Ca2+超載、炎性反應、自由基生成增加等因素，最終觸發細胞凋亡[8]。研究表明，內源性大麻素類物質具有中樞保護作用，主要與其抗凋亡，減輕炎癥反應造成的繼發性神經損傷的保護作用，調節多種類型神經細胞的死亡與存活，抑制誘生型一氧化氮合酶的表達。提示AM1241通過作用于神經損傷的多個環節，從而抑制細胞凋亡。

Bcl-2是B淋巴瘤-2基因(bcl-2)家族中重要的抗細胞凋亡基因，其功能與抑制細胞凋亡、延長細胞生存有關[9-10]。本研究結果表明,海馬細胞缺氧-復氧損傷后,bcl-2表達明顯減少，5、10 μmol/L AM1241預處理可顯著增加bcl-2的表達,可見，AM1241是通過調節海馬細胞bcl-2基因的表達，抑制細胞凋亡來發揮其抗損傷作用。 在缺氧的調節下，iNOS被激活并產生NO，后者是導致神經系統損傷的主要因素。內源性大麻素可以通過抑制多種信號通路的轉錄來抑制iNOS的生成[11]。研究發現，內源性大麻素通過減少神經元產生的炎癥因子，減輕炎癥反應造成的繼發性神經損傷的保護作用[12]。本研究發現，5、10 μmol/L AM1241預處理可以明顯提高海馬神經元的增殖能力，并減少iNOS mRNA的表達。表明iNOS在AM1241預處理神經元的保護作用起到了重要作用。

綜上所述，用一定濃度的AM1241預處理對大鼠海馬神經元缺氧損失有一定的保護作用，其機制與增加bcl-2的表達，減少凋亡基因caspase-3和iNOS mRNA的表達相關。然而，AM1241對神經元的保護作用的機制尚需進一步證實。

[1]趙雅寧,李建民,常學優,等.糖尿病大鼠全腦缺血再灌注海馬區Ku70表達和神經細胞凋亡變化[J].西安交通大學學報,2013,34(4):474-478.

[2]接琳琳,管英俊,陳燕春,等.星形膠質細胞與神經元間通訊的研究進展[J].解剖科學進展,2014,20(6):581-584.

[3]Alonso-Alconada D,lvarez A,lvarez-Granda L,et al.Therapeutic potential of the endocannabinoid system in perinatal asphyxia[J].Rev Neurol,2011,53(12):758-764.

[4]余飛,吳一芳,蘇少華,等.內源性大麻素系統對神經系統保護作用的研究進展[J].外科研究與新技術,2014,3(3):212-214.

[5]Rettori E,De Laurentiis A,Zorrilla ZM,et al.Anti-inflammatory effect of the endocannabinoid anandamide in experimental periodontitis and stress in the rat [J].Neuro-immunomodulation,2012,19(5):293-303.

[6]李素艷,顏玲娣,宮澤輝.大麻CB2受體在中樞神經系統的分布及其激動劑的藥理作用[J].中國藥理學通報,2009,25(1):5-8.

[7]Salnikow K,Donald SP,Bruick RK,et al.Depletion of intracellular ascorbate by the carcinogenic metals nickel and cobalt results in the induction of hypoxic stress[J].J Biol Chem,2004,279(39):40337-40344.

[8]李琴,郭云良,李震,等.胡黃連苷Ⅱ對大鼠腦缺血/再灌注損傷Caspase-3和PARP表達的影響[J].中國藥理學通報,2010,26(3):342-345.

[9]Li Q,Guo YL,Li Z,et al.The interference of picrosideⅡ on the expressions of Caspase-3 and PARP following cerebral ischemia reperfusion injury in rats[J].Chin Pharma Bull,2010,26(3):342-345.

[10]李冬,張紅.磷脂酰肌醇3激酶/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶/核轉錄因子κB信號通路對細胞凋亡影響的研究進展[J].中國醫藥導報,2014,11(33):166-168.

[11]賀芳,葉蓓,陳建珍,等.HGF對腦缺血/再灌注大鼠腦iNOS,NO及IL-1p的影響[J].中南大學學報,2014,39(1):23-28.

[12]Brighton PJ,Marczylo TH, Rana S,et al.Characterization of the endocannabinoid system CB(1) receptor signalling and desensitization in human myometrium[J].Br J Pharmacol,2011,164(5):1479-1494.

Neuroprotection of CB2 agonist preconditioning of different concentration on rat hippocampal neurons apoptosis and its mechanism

FENG Ya-nia,SHI Qiangb*

(a.Department of Anesthesiology,b.Department of Neurosurgery,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shengyang 110001,China)

ObjectiveTo determine the effects of CB2 agonist AM1241 preconditioning on rat hippocampal neurons apoptosis induced by anoxia-reoxygenation.MethodsHippocampal neurons were cultured and randomly assigned to six groups:control group;CoCl2group,in which cells were treated with 300 μM CoCl2(chemical anoxia analogue) for 4 h,cultured with normal medium for 24 h,and then stimulated with out serum media;AM1241 1 μmol/L,AM1241 3 μmol/L,AM1241 5 μmol/L and AM1241 10 μmol/L group:the neurons were pretreated with 1,3,5,and 10 μM AM1241,then 300 μM CoCl2were added after 2 h，then the others were the same as CoCl2group. MTT method was used to detect the proliferation of neurons.Then RT-PCR method was used to determine the expression of bcl-2,caspase-3,iNOS mRNA.ResultsCompared with AM1241 1 μmol/L and AM1241 3 μmol/L group,when pretreated with 5 μM and 10 μM AM1241,cell proliferation increased (P<0.05 orP<0.01).The bcl-2 mRNA was up-regulated,and caspase-3 and iNOS mRNA were down-regulated (P<0.05 orP<0.01).ConclusionPreconditioning with 5 μM and 10 μM AM1241 can protect hippocampal neurons against anoxia-reoxygenation injury by attenuating apoptosis.

CB2 receptor;Cell apoptosis;Hippocampus;Neurons

2015-08-12

中國醫科大學附屬第一醫院a.麻醉科，b.神經外科,沈陽110001

遼寧省教育廳科學研究項目(L2014293)

10.14053/j.cnki.ppcr.201609003