三維準連續ASL評價兔軟組織腫瘤抗血管生成的可行性研究

閆力永，查云飛，邢棟，王克軍，龔威，胡磊，王嬌，劉昌盛

三維準連續ASL評價兔軟組織腫瘤抗血管生成的可行性研究

閆力永，查云飛*，邢棟，王克軍，龔威，胡磊，王嬌，劉昌盛

目的 通過病理對照來研究三維準連續性動脈自旋標記(3D-PCASL)用于評價兔軟組織VX2腫瘤抗血管生成的可行性。材料與方法 24只新西蘭瘤兔大腿下段肌肉內VX2腫瘤接種成功，對實驗組12只和對照組12只瘤兔分別采用恩度(endostatin)/鹽水比例為1.5 mg/8 ml溶液和0.9%生理鹽水8 ml連續瘤周肌注14 d。瘤兔下肢采用3D-PCASL序列進行掃描，3D-PCASL選取腫瘤組織最大層面，分別測量腫瘤邊緣和腫瘤中心灌注參數BFASL值，與病理指標微血管密度（MVD）和血管內皮生長因子（VEGF）表達狀況進行對照。結果 實驗組腫瘤邊緣及中心區域MVD值分別與BFASL值具有良好的相關性(r=0.891、r=0.626，P＜0.05)，對照組腫瘤中心及邊緣治療后MVD值分別與BFASL值具有良好的相關性(r=0.960、r=0.917，P＜0.05)，均與VEGF的表達情況相對應。結論 BFASL值與MVD值在軟組織VX2腫瘤抗血管生成治療前后具有良好的相關性，3D-PCASL技術用于評價軟組織腫瘤抗血管生成治療是可行的。

磁共振成像；軟組織腫瘤；血管抑制素類

ACKNOWLEDGMENTS This work was part of natural science foundation of Hubei province （ No. 2013CFB242） and scientifc research project of health department of Hubei (No. JX6B68).

閆力永, 查云飛, 邢棟, 等. 三維準連續ASL評價兔軟組織腫瘤抗血管生成的可行性研究. 磁共振成像, 2016, 7(9): 689-693.

目前，尚未見3D-PCASL應用于軟組織腫瘤抗血管生成治療評價的相關報道，筆者采用3D-PCASL和病理對照研究評價恩度對軟組織VX2腫瘤抗血管生成的療效，旨在探討3D-PCASL技術用于評價軟組織腫瘤抗血管生成治療的可行性。

1　材料與方法

1.1材料

兔軟組織VX2腫瘤模型制作：純種新西蘭白兔24只，購于武漢大學動物房，月齡3～4個月，體重2.5～3.0 kg，雌雄不限。VX2瘤株購于華中科技大學附屬協和醫院。病理所需材料及儀器：石蠟、甲醛、二甲苯、無水乙醇、30% H2O2、羊血清、DAB濃縮型試劑盒、中性樹脂、二抗及三抗、PBS溶液KH2PO4、 檸檬酸C6H8O7·H2O、檸檬酸鈉Na3C6H5O7·2H2O、正置顯微鏡、恒溫烘箱、石蠟切片機、攤片機、移液器、水浴鍋、IMS圖像分析系統、數碼相機等。本實驗經倫理委員會審查通過。

1.2方法

將凍存的VX2腫瘤組織塊在－20℃至－4℃條件下復蘇，在無菌條件下將其剪成1 mm3的組織碎片，加入適量生理鹽水配成腫瘤碎片懸浮液，注射于24只兔后肢肌肉內，2周后通過MRI平掃，在兔股骨上段周圍軟組織內可見直徑10～30 mm大小的軟組織腫塊，即制成動物模型。

影像檢查設備及技術：采用美國GE750 3.0 T MR掃描儀，瘤兔靜脈麻醉成功后俯臥位固定于特制的動物固定模具上，用標準膝關節線圈進行掃描。24只瘤兔隨機分為兩組：(1)對照組12只；(2)實驗組12只；實驗組用恩度：鹽水比例為1.5 mg/8 ml溶液，連續對每只瘤兔每晚同一時間段進行瘤周肌注，為期兩周。對照組用0.9%生理鹽水8 ml替代恩度溶液，方法同實驗組。瘤兔下肢分別在給藥前及給藥兩周結束后行常規MRI檢查，包括FSE-T2WI (TR 2500 ms，TE 38 ms/Ef)、FSE-T1WI序列(TR 400 ms，TE 19.4 ms/Ef)，層厚3 mm，層間距2 mm，矩陣512×512，EC1/1 31.2 kHZ，FOV 110 mm×110 mm。3D-PCASL采用背景抑制、偽連續性標記、螺旋K空間填充的FSE信號讀取方式，標記延遲時間(PLD) 1525 ms，反轉角111°，激勵3次，EC1/1 62.5 kHZ，層厚3 mm，層數32層，層間距0 mm， TR 4388.0 ms，TE 10.9 ms，FOV 110 mm×110 mm，矩陣512×8，掃描時間為4 min 15 s。掃描獲得的兔軟組織腫瘤橫斷位ASL原始圖像用AW 4.6工作站(GE Healthcare ) Functool軟件進行后處理，生成灌注參數BF偽彩圖。選取通過腫瘤長軸最大徑的橫斷面，確定腫瘤中心點，建立二維坐標并作最小外切圓，量取X與Y軸上腫瘤邊緣至中央徑線的10%點，以此點與腫瘤中心點之間的距離為半徑作同心圓，兩圓之間的區域定義為腫瘤周邊。如果腫瘤直徑＞5 cm，則選擇腫瘤邊緣內延5 mm的區域作為腫瘤邊緣區域[11]，其余區域均作為腫瘤中心。在腫瘤最大層面，分別在腫瘤邊緣和腫瘤中心取三個感興趣區(ROI)，直徑約5 mm，避開腫瘤壞死、囊腫、正常血管等區域，分別測得腫瘤邊緣及中心BFASL值，取平均值， 20只瘤兔給藥前后共得到80個BFASL平均值。

病理學觀察及定量分析：瘤兔行MRI掃描結束后，在武大第一臨床學院無菌實驗室用空氣栓塞法將其處死，參照MRI感興趣區對腫瘤組織的邊緣及中心進行取材，剝離腫瘤的壞死區域，用4%的多聚甲醛固定，分別裝入不同標記的瓶子中，用石蠟進行包埋、切片，行常規的HE染色、CD31及VEGF抗體標記血管內皮細胞。選擇高倍鏡視野( ×200)，按染色深淺分為4級：未見染色為0分(－)，染成淺黃即輕度染色為1分( + )，染成棕黃即中度染色為2 分( ++ )，染成棕褐色即重度染色為3分( +++ )；陽性細胞百分比：未見染色為0分(－)，染色細胞< 25%為1分(+)，染色細胞＞25% 且< 50%為2分( ++ )，染色細胞＞50% 為3分( +++ )；兩者積分0～2分判定為陰性，＞2分為陽性[12]。用低倍鏡 ( ×40)選擇微血管密集區，再在高倍鏡下( ×200)選擇5個視野計取微血管數目，取其平均值作為MVD值。微血管的計數標準：與其他微血管、瘤胞或結締組織分開的單個棕黃色內皮細胞或內皮細胞團作為一根血管，血管肌層較厚的不計數，管腔大于8個紅細胞直徑的不計數，除外纖維化、出血及邊緣反應區。血管內皮生長因子（VEGF）以腫瘤細胞的胞質內顯示棕黃色顆粒作為陽性，1%～25%、≥25%～50%、≥50%～75%、≥75%陽性細胞表達率分別對應為弱陽性、陽性、較強陽性及強陽性[1]。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0軟件，定量資料以均數±標準差表示，軟組織VX2腫瘤中心及邊緣區域平均MVD值、BFASL值差異分別采用獨立樣本t檢驗，MVD值與BFASL參數的相關性采用Pearson相關分析，所有統計分析結果以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1　實驗組和對照組腫瘤邊緣及中心BFASL與MVD值比較Tab. 1 Comparison of the BFASL、MVD of tumor margin and center between the experimental group and the control group

2　結果

2.1實驗動物情況

324只新西蘭兔腫瘤種植均成功，2只實驗組瘤兔在行MRI掃描前，因麻醉意外死亡；2只對照組瘤兔在動物房飼養過程中意外死亡；最終實驗組和對照組各10只動物完成MRI掃描。

2.2滲透性參數與免疫組化定量分析對照

實驗組與對照組腫瘤中心與邊緣MVD值、BFASL值差異均具有統計學意義(P＜0.05)；對照組腫瘤中心及邊緣MVD值、BFASL值治療后較治療前增大，其差異均具有統計學意義(P＜0.05)。實驗組治療后腫瘤中心及邊緣VEGF表達均較治療前及對照組減低；20只瘤兔ASL顯示中心區域局部不同程度血流灌注缺失，病理結果提示腫瘤中心區域局部組織壞死(表1；圖1～8)。

2.3實驗組VX2腫瘤MVD值與BFASL灌注參數相關性分析

實驗組腫瘤邊緣及中心區域MVD值與BFASL值具有良好的相關性(r=0.891、r=0.626；P值均＜0.05) (圖9，10)。對照組腫瘤邊緣及中心區域MVD值與BFASL值具有良好的相關性(r=0.960、r=0.917；P值均＜0.05) (圖11，12)。

3　討論

血管生成是腫瘤生長、侵襲及轉移過程中最為重要的環節，抑制腫瘤血管生成已成為近年來抗腫瘤治療熱點，VEGF可以促進腫瘤血管生成，使腫瘤組織MVD增加[13-14]。本實驗通過3D-PCASL灌注成像及病理對照，對兔軟組織VX2腫瘤恩度抗血管生成治療進行評價，結果顯示腫瘤邊緣血供豐富，中央區域血供相對較少，證實軟組織VX2腫瘤具有血供區域分布異質性特點。實驗組腫瘤邊緣及中心治療后BFASL、MVD值及VEGF表達均較治療前及對照組降低，證實恩度通過抑制血管內皮細胞遷移、減少腫瘤新生血管形成、改善血管異構以及降低血管通透性的機制發揮抗腫瘤血管生成的作用。

本研究通過恩度對兔軟組織VX2腫瘤進行抗血管生成干預，采用3D-PCASL來評價軟組織VX2抗血管生成前后的血流灌注變化，并通過病理對照，來驗證3D-PCASL評價軟組織VX2血流灌注變化的可行性。3D-PCASL采用了更長凈讀取時間，通過自旋回波信號采集，進一步減少了信號回落和圖像在高梯度回波區域失真，有助于獲得高質量的圖像；同時，全部三維影像在相同的流入時間獲取，避免由于標記血到達成像區域的時間差異對圖像造成影響，提高了信噪比，更好地保證參數的準確性。本研究結果顯示恩度抗腫瘤血管生成后，腫瘤邊緣及中心區域的BFASL值、MVD值具有良好的相關性。證實3D-PCASL用于評價軟組織腫瘤抗血管生成治療是可行的。

圖1～4　圖1，2 分別為兔軟組織VX2腫瘤恩度治療前軸位T2WI、BFASL值偽彩圖，腫瘤邊緣區域較中心區域灌注參數增高；圖3，4 分別為治療后T2WI、BFASL值偽彩圖，腫瘤體積持續增大，腫瘤邊緣及中心區域灌注參數較治療前均有明顯減低，腫瘤中心可見壞死區 圖5～8 圖5，6分別為實驗組腫瘤組織邊緣治療前后CD31染色后鏡下照片( ×200)，血管被染成紫褐色(箭頭)，MVD治療后較治療前明顯減少；圖7，8 分別為治療前后腫瘤組織邊緣VEGF染色后組織的鏡下照片( ×200)，腫瘤細胞胞質內出現棕褐色顆粒(箭頭)，治療后較治療前表達減弱Fig. 1—4 Fig.1, 2: The T2WI and BFASL pseudo-color images of tumor pretherapy, the perfusion para-meters of tumor margin were higher than tumor centers. Fig.3, 4: The T2WI and BFASL pseudo-color images of tumor after treatment. Tumor was biger and biger, the perfusion parameters of tumor margin and centers were lower than pretherapy, there was necrosis area in tumor centers. Fig. 5—8 Fig.5， 6： The microphotograph （ ×200） of the margin of the experimental group tumors before and after treatment， using CD31 staining. The blood vessels were stained purple brown （arrows）， the MVD after treatment was obviously decreased than before treatment. Fig.7， 8： The microphotograph （ ×200） of the margin of the experimental group tumors before and after treatment， using VEGF staining. There were brown granules in tumor cell （arrows）， the VEGF expression after treatment was obviously weakened than before treatment.

圖9　實驗組腫瘤邊緣MVD與BFASL相關性分析 圖10 實驗組腫瘤中心MVD與BFASL相關性分析 圖11 對照組腫瘤邊緣MVD與BFASL相關性分析 圖12 對照組腫瘤中心MVD與BFASL相關性分析Fig. 9 The correlation analysis between MVD and BFASL of tumor margin of experimental group. Fig. 10 The correlation analysis between MVD and BFASL of tumor center of experimental group. Fig.11 The correlation analysis between MVD and BFASL of tumor margin of control group. Fig.12 The correlation analysis between MVD and BFASL of tumor center of control group.

本研究局限：(1) 3D-PCASL評價軟組織灌注的最佳反轉恢復時間TI值尚待進一步優化；(2)病理取材位置與ASL滲透性參數的ROI無法完全一一對應，MVD檢測中每200倍視野微血管計數的人為主觀偏差不容忽視；(3)本實驗軟組織VX2腫瘤生長較快，出現腫瘤中心區域壞死的比例較高，與臨床軟組織惡性腫瘤病例的病程不完全一致，評價惡性腫瘤血供的區域異質性尚待深入研究。

總之，軟組織腫瘤抗血管生成治療前后，3D-PCASL的BFASL值與腫瘤的MVD值具有良好的相關性，用于評價軟組織腫瘤抗血管生成治療是可行的。

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The feasibility study of 3D-PCASL evaluating the antiangiogenesis of soft tissue tumor

YAN Li-yong, ZHA Yun-fei, XING Dong, WANG Ke-jun, GONG Wei, HU Lei, WANG Jiao，LIU Chang-sheng
Department of Radiology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China

*Correspondence to: ZHA Yun-fei, E-mail: zhayunfei999@126.com

Objective: To investigate the feasibility of anti-angiogenesis of VX2 soft tissue tumor by 3D-PCASL and MVD. Materials and Methods: VX2 tumor was inoculated in the muscular tissue of lower section of femur of 24 New Zealand rabbits successfully. The experimental group and the control group contained 12 subjects, respectively injected in muscles around the tumor with Endostar solution (Endostar: saline ratio of 1.5 mg/8 ml) and 0.9% saline 8 ml，for a period of 14 days. BFASL values were respectively measured by arterial spin labeling (ASL) via selecting the tumor maximum level. BFASL values were compared with those parameters of pathology， which including MVD and VEGF. Results: The MVD values of the central and margin region of experimental group showed a positive correlation with BFASL values (r= 0.891, r= 0.626, P＜0.05 ）， the MVD values of the central and margin region of control group showed a positive correlation with BFASL values (r=0.960, r=0.917, P＜0.05) ，they all corresponded to the expression of VEGF. Conclusions: The BFASL values and the MVD values showed a positive correlation in evaluation of antiangiogenesis of VX2 soft tissue tumor. The 3D-PCASL might be feasible for evaluation of anti-angiogenesis of soft tissue tumor.

Magnetic resonance imaging; Soft tissue neoplasms; Angiostatins

9 Apr 2016, Accepted 18 May 2016

湖北省自然科學基金項目(編號：2013CFB242)；湖北省衛生廳科研資助項目(編號：JX6B68)

武漢大學人民醫院放射科，武漢430060

查云飛，E-mail：zhayunfei999@126. com

2016-04-09

接受日期：2016-05-18

R445.2

A

10.12015/issn.1674-8034.2016.09.010

實體腫瘤的生長、侵襲及轉移依靠腫瘤血管生成，抑制腫瘤血管生成已成為抗腫瘤治療的新熱點[1]。抗血管生成治療主要是通過抑制內皮細胞遷移、吸附、活化和增殖或直接針對腫瘤血管靶分子等機制，以達到抑制血管生成的目的[2]。恩度(Endostatin)是國內首例重組人血管內皮抑制素，可以多靶點發揮抗血管生成作用[3]。動脈自旋標記灌注成像是指采用內源性示蹤劑，即動脈血中水分子的動脈自旋標記(arterial spin labeling，ASL)來研究組織的灌注水平的成像技術[4]。由于其具有無創性，在評價腦血管病、腦腫瘤病變的診斷、治療及預后等方面顯示了其獨特的優勢，而在體部及骨肌系統疾病評估中的應用尚處于探索階段[5]。肖華鋒等[6]利用三維準連續動脈自旋標記灌注成像對WHO Ⅱ級膠質瘤的臨床分型意義進行了初步研究，Cho等[7]利用基于FAIR序列的2D ASL評價軟組織腫瘤的血量灌注情況，證明ASL評價軟組織腫瘤血流灌注是可行的。3D-PCASL是一種全新容積灌注成像技術，采用準連續性標記、Spiral K空間采集、FSE讀取方式，同傳統2D ASL相比，信噪比明顯增加，應用自旋回波及梯度回波技術，有更高的讀出帶寬及背景抑制，對減少圖像失真及減少磁敏感偽影有積極的意義[8-10]。