植物組織培養中褐變的影響因素及防止措施

周亞輝

摘要 褐變問題在植物組織培養過程中普遍存在，嚴重影響了外植體的生長與分化，結合國內外研究褐變的相關報道，綜述了植物組織培養中褐變的影響因素和防止措施。

關鍵詞 植物組織培養；褐變；影響因素；防止措施

中圖分類號 Q813.1+2 文獻標識碼 B 文章編號 1007-5739（2016）05-0117-02

近年來，隨著科學技術的迅猛發展，植物組織培養已成為生物學科中的重要研究技術和手段之一，其被廣泛應用于科研和生產，在農學、花卉、林業、醫藥業等領域中取得了巨大的經濟、社會效益。但是，植物組織培養過程中褐變問題普遍存在，褐變的發生會嚴重影響外植體的生長與分化，甚至導致培養材料的死亡，褐變問題已成為組織培養中的一大難題。褐變的影響因素是復雜的，隨外植體種類、基因型、取材部位及生理狀況等的不同而危害程度有所區別，國內外也研究報道了一些減少或防止褐變的方法。本文系統歸納了植物組織培養褐變的影響因素和防止措施，對深入研究褐變問題和組織培養技術都有著非常重要的意義。

1 褐變的影響因素

1.1 外植體基因型

在植物組織培養中，有些品系容易褐變，誘導困難，而有些品系褐變較少，愈傷組織化容易些，組培容易成功，其原因之一可能是酚類物質含量及多酚氧化酶活性上的差異。

1.2 外植體的生理狀態

外植體本身的生理狀態不同，接種后褐變的程度也不同。致褐物質的含量會因生理年齡、季節、取材時間及部位的不同而不同。

1.3 培養基成分和培養條件

無機鹽濃度、培養基pH值、培養基狀態及植物激素等不適宜，均會引起褐變的產生。此外，培養過程中溫度過高或光照過強，也會加速褐變的產生。

1.4 培養時間

接種后轉瓶時間的早晚也是影響褐變的因素，接種后外植體培養時間過長，未及時轉瓶，會使培養材料傷口積累過多酚類物質，導致褐變。

2 褐變的防止措施

2.1 外植體的選擇

2.1.1 基因型。在相同培養條件下，甜菜二倍體品系外植體發生褐變的頻率低于四倍體品系。Dalal等[1]比較2個葡萄品種“Pusa Seedless”和“Beauty Seedless”的褐變時，發現后者比前者嚴重，酚類化合物含量也是后者明顯高。因此，在組織培養中應注意不同基因型的篩選，選擇褐變程度較小的材料來進行培養。

2.1.2 生理年齡。外植體年齡對褐變有較大影響，Chevre分析表明歐洲栗幼齡材料酚類化合物含量少，而成齡材料比較多。周 艷等[2]研究發現馬纓杜鵑的二年生莖段在組織培養過程中的褐變率最低。

2.1.3 取材時期。致褐物質的含量會因季節的不同而不同，冬季褐變少，夏秋季褐變最嚴重，存活率最低。對柿樹離體繁殖中外植體的褐變研究結果表明，2月取即將萌動的休眠芽進行培養，褐變死亡率低，4月取嫩枝莖尖進行培養，褐變死亡率高[3]。紫葉黃櫨在1月取休眠枝條組織培養后外植體褐變程度最輕。

2.1.4 取材部位。平陰玫瑰不同品種、同一品種不同芽位的外植體在組培中褐變發生情況不同，但5個品種各芽位的平均褐變度均呈單峰型變化，且峰值均在第4芽。張素勤等[4]研究報道，非洲菊幼嫩葉片、花蕾、花托和花梗不同外植體中葉片的褐變程度最重，花蕾的褐變程度最輕。

2.2 外植體的預處理

在非洲菊葉片組織培養接種前將外植體用100 mg/L VC溶液浸泡1 h，使褐變現象得到有效控制[4]。青錢柳外植體先于4 ℃低溫預處理5 d和直接用燒紅的手術刀快速切割外植體后再進行接種可有效減少外植體的褐變。紫葉黃櫨嫩莖組織培養前經0.1% HgCl2滅菌2～3 min，外植體褐變程度最輕。

2.3 適當的培養基狀態和成分

2.3.1 培養基狀態。液體培養基可有效克服外植體褐變，因為在液體培養基中，外植體溢出的有害物質可以很快擴散，對外植體傷害較輕。潘 梅等[5]在淮山組織培養抑制褐變的研究中發現液體培養淮山組織褐變程度較固體培養輕。尚旭嵐等[6]研究報道，鶴望蘭紙橋液體培養可以有效降低外植體的褐變度。

2.3.2 培養基成分。選擇適宜的無機鹽成分、蔗糖濃度和激素水平也是十分重要的。牛尾菜組織在不同激素配比的培養基中，隨著6-BA和NAA濃度的提高，外植體發生褐化時間呈現提前的趨勢。此外，相對于基本培養基MS、1/2MS，在低無機鹽離子濃度WPM基本培養基中，可減緩外植體褐化程度。銀杏組織培養在蔗糖濃度為5%的培養基上，愈傷組織增長倍數最高。

2.3.3 添加抗氧化劑和吸附劑。在植物組培中常用于抑制褐變的抗氧化劑有抗壞血酸、硫代硫酸鈉、多胺等，常用的吸附劑有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等。鄭曉丹等[7]發現海南龍血樹組織培養抗褐變的最適處理是培養基里加入維生素C然后泡半胱氨酸。魔芋組織培養中在培養基中分別添加活性炭、半胱氨酸、二氧化硫、聚乙烯吡咯烷酮或抗壞血酸等都能有效降低魔芋組織培養中的褐變率[8]。

2.4 合適的培養條件

溫度過高或光照過強，可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速培養材料的褐變，尤其是初期暗培養及保持較低溫度（15～20 ℃）有降低褐變的作用[9]。卡特蘭在10～20 ℃時褐變程度要比20 ℃以上時輕。魔芋組織培養中溫度25～30 ℃、光照1 500 lx的條件下培養物褐變率僅為6%，愈傷組織誘導率達94%，成功率最高。

2.5 縮短轉瓶時間

及時轉接培養物可減輕醌類物質對培養物的毒害作用，顯著減少材料的褐變。在山月桂樹的莖尖培養中，接種后12～24 h便轉入液體培養基中，然后每天轉移1次，連續1個星期，褐變便得到完全控制[9]。軟棗獼猴桃組織培養過程中每隔10～15 d轉換1次培養基可有效控制褐變并保持植株正常生長。

3 參考文獻

[1] DALAL MA，SHANNA BB，RAO MS.Studies on stock plant treatment and initiation culture mode in control of oxidative browning cultures of grapevine[J].Sci Hort，1992（51）：35-41.

[2] 周艷，陳訓.馬纓杜鵑組織培養過程中外植體褐變與多酚氧化酶及酚類物質的關系[J].種子，2009，28（7）：61-63.

[3] 張妙霞，孔祥生，郭秀璞，等.柿樹組織培養防止外植體褐變的研究[J].河南農業大學學報，1999，33（1）：89-93.

[4] 張素勤，鄒志榮，耿廣東，等.非洲菊組織培養抑制褐變現象的研究[J].貴州農業科學，2007，35（2）：56-57.

[5] 潘梅，王景飛，黃賽，等.淮山組織培養抑制褐變的研究[J].江蘇農業科學，2014，42（6）：57-59.

[6] 尚旭嵐，張健，夏晗.鶴望蘭組織培養的褐變因素及防止措施[J].四川農業大學學報，2003，21（3）：61-64.

[7] 鄭曉丹，胡燕梅.海南龍血樹組織培養及抗褐變的研究[J].武漢生物工程學院學報，2011，7（4）：235-237.

[8] 李劍美，寸湘琴，謝世清.魔芋組織培養中的褐變機理及防控措施[J].中國農學通報，2006，22（5）：234-236.

[9] 曹孜義，劉國民.實用植物組織培養技術教程[M].蘭州：甘肅科學技術出版社，2003：48-49.