膝骨關節炎患者血漿和關節滑液中microRNA-365的表達水平及其臨床意義

楊　治　張　銘　劉　林　彭　侃　許　鵬

西安交通大學醫學院附屬紅會醫院關節外科，陜西西安710054

膝骨關節炎患者血漿和關節滑液中microRNA-365的表達水平及其臨床意義

楊治張銘劉林彭侃許鵬▲

西安交通大學醫學院附屬紅會醫院關節外科，陜西西安710054

目的探討膝骨關節炎（KOA）患者血漿和關節滑液中microRNA-365（miR-365）的表達水平及其臨床意義。方法選取2015年5月～2016年5月在西安交通大學醫學院附屬紅會醫院住院治療的52例膝骨關節炎患者和43例膝關節半月板損傷患者作為研究對象，采用定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測患者血漿和關節滑液中miR-365的表達水平，并統計分析膝骨關節炎患者血漿和關節滑液中miR-365的表達水平的相關性。結果膝骨關節炎患者血漿、關節滑液中miR-365水平分別為（1.69±0.42）、（1.44±0.36），膝關節半月板損傷患者血漿、關節滑液中miR-365水平分別為（1.28±0.27）、（1.25±0.19），二者比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。相關分析顯示膝骨關節炎患者血漿中miR-365水平與關節滑液中的水平之間呈正相關（r=0.631，P<0.05）。結論膝骨關節炎患者血漿、關節滑液中miR-365水平增高，提示miR-365可能參與了膝骨關節炎的病理過程。

骨關節炎；微小RNA；血漿；關節滑液

［Abstract］Objective To detect the plasm and joint synovia levels of microRNA-365（miR-365）in the patients with knee osteoarthritis and explore their clinical significances.Methods 52 patients with knee osteoarthritis and 43 patients with knee joint meniscus injury in Hong Hui Hospital，Xi'an Jiaotong University College of Medicine from May 2015 to May 2016 were enrolled in the study.The plasm and joint synovia levels of miR-365 were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.The relationships between the plasm and joint synovia levels of miR-365 in patients with knee osteoarthritis were analyzed.Results The plasma levels of miR-365 in the patients with knee osteoarthritis（1.69±0.42）were statistically higher than those in the patients with knee joint meniscus injury（1.28±0.27）（P<0.01）.Compared with the patients with knee joint meniscus injury（1.25±0.19），the joint synovia levels of miR-365 in the patients with knee osteoarthritis（1.44±0.36）were statistically higher（P<0.01）.The plasm levels of miR-365 were positive correlation with joint synovia levels（r=0.631，P<0.05）.Conclusion The plasm and joint synovia levels of miR-365 increase in the patients with knee osteoarthritis.miR-365 may involve in the pathology of knee osteoarthritis.

［Key words］Osteoarthritis；MicroRNA；Plasm；Joint synovia

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種伴隨疼痛和膝關節運動障礙的慢性退行性關節疾病，主要病理改變是膝關節軟骨面的退行性變和繼發性的骨質增生。原發性膝骨關節炎的發病原因目前尚不清楚，可能是多因素綜合作用的結果，增齡、肥胖、勞損、創傷、關節先天性異常、關節畸形等諸多因素與原發性膝骨關節炎的發病有關［1-5］。膝骨關節炎無特異的治療方式，主要是減少關節的負重和過度的大幅度活動，以延緩病變的進程［6-8］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長度為22個左右核苷酸的非編碼單鏈小RNA，參與轉錄后的基因表達調控，在細胞分化、生物發育及各種疾病的發生發展過程中發揮重要作用［9-10］。研究表明多種miRNAs在骨關節炎中表達異常，在疾病的發生發展中發揮一定作用［11-16］，Xu等［17］通過體內外實驗研究發現骨關節炎軟骨細胞的miR-365的表達水平遠遠高于正常的軟骨細胞。為了進一步研究miR-365在骨關節炎中的作用，本研究利用定量聚合酶鏈反應（transcription polymerase chain reaction，PCR）檢測52例膝骨關節炎患者和43例膝關節半月板損傷患者血漿和關節滑液中miR-365的表達水平，旨在初步探討miR-365在膝骨關節炎發生發展中的作用。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2015年5月～2016年5月在西安交通大學醫學院附屬紅會醫院（以下簡稱“我院”）關節外科住院治療的膝骨關節炎患者52例，其中男24例，女28例，年齡45～72歲，平均（61.24±11.63）歲，所有患者診斷均符合1986年美國風濕病學會提出的診斷標準［18］，排除標準：合并腫瘤、自身免疫性疾病、類風濕關節炎、血液系統疾病、炎癥性疾病及嚴重心肝腎疾病。同期在我院關節外科住院治療的43例外傷導致的單純膝關節半月板損傷患者為對照組，其中男20例，女23例，年齡40～67歲，平均（57.71±10.36）歲，排除標準：合并骨關節炎、腫瘤、自身免疫性疾病、類風濕關節炎、血液系統疾病、炎癥性疾病及嚴重心肝腎疾病。兩組研究對象性別、年齡比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究獲得醫院倫理委員會的批準并得到所有研究對象知情同意。

1.2試劑與儀器

miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒、內參照U6（CD201-0145）及miR-365（CD201-0367）引物均購自天根生化科技（北京）有限公司，高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，紫外分光光度計購自美國Thermo Scientific公司，定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1樣本采集所有膝骨關節炎和膝關節半月板損傷患者均在治療前空腹采集EDTA抗凝血5.0 mL，并在膝關節穿刺時采集關節滑液500 μL。血液及關節滑液分別在室溫下2500 r/min及3000 r/min離心10 min，分離上層血漿或關節滑液至EP管中，4℃12000 r/min再次離心10 min，分別吸取上清至新的EP管中，置于-80℃保存。

1.3.2血漿及關節滑液中miR-365水平的檢測取200 μL血漿或關節滑液，采用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取總RNA，提取的RNA溶解于20 μL DEPC水中，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。利用紫外分光光度儀測定提取的RNA液的OD260、OD280值，二者比值在1.8～2.1范圍的RNA為合格，可用于下一步的逆轉錄反應。利用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行逆轉錄反應，20 μL的逆轉錄反應體系包括2 μL RNA、10 μL 2× miRNA RT反應緩沖液、2 μL miRNA逆轉錄酶、6 μL無RNA酶水，逆轉錄反應條件：42℃60 min、95℃3 min，合成的cDNA放置于-20℃保存待用。采用內參照U6（CD201-0145）及miR-365（CD201-0367）引物及miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒進行定量PCR擴增，20 μL PCR反應體系具體如下：10 μL 2×miR-cute Plus miRNA Premix、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、1 μL cDNA、2 μL 50×ROX Reference Dye、6.2 μL雙蒸水，PCR反應條件：95℃預變性15 min，94℃20 s、60℃34 s，共40個循環。每個樣本的每個基因均設立3個復孔，擴增結束后自動獲得循環閾值即Ct值，基因表達水平采用2-△△Ct進行分析，ΔΔCt=實驗組ΔCt（目的基因Ct-內參基因Ct）-對照組ΔCt（目的基因Ct-內參基因Ct）。

1.4統計學方法

利用SPSS 16.0軟件對所有數據進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，計數資料比較采用檢驗，膝骨關節炎患者血漿與關節滑液中miR-365水平的相關性采用Pearson相關法進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1膝骨關節炎與膝關節半月板損傷患者血漿、關節滑液中miR-365水平的比較

定量PCR檢測結果顯示：與膝關節半月板損傷患者血漿、關節滑液中miR-365水平比較，膝骨關節炎患者血漿、關節滑液中miR-365水平明顯增高，差異有統計學意義（P<0.01）；膝骨關節炎患者血漿中miR-365水平明顯高于關節液中的水平，差異有統計學意義（P<0.01）；而膝關節半月板損傷患者血漿、關節液中miR-365水平的差異沒有統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1　2組研究對象血漿、關節滑液中miR-365水平的比較（?）

2.2膝骨關節炎患者血漿與關節滑液中miR-365水平的相關性

相關分析顯示膝骨關節炎患者血漿中miR-365水平與關節滑液中的水平之間呈正相關（r=0.631，P< 0.05）。

3　討論

骨關節炎是多種原因引起的關節軟骨退化損傷、關節邊緣和軟骨下骨反應性增生，臨床主要表現為緩慢發展的關節疼痛、壓痛、僵硬、關節腫脹、活動受限和關節畸形等。X線表現為關節間隙變窄，軟骨下骨質致密，骨小梁斷裂，有硬化和囊性變，關節邊緣有唇樣增生，骨關節炎發病機制尚未完全清楚，增齡、肥胖、勞損、創傷、關節先天性異常、關節畸形等諸多因素與原發性骨關節炎的發病有關［1-5］。

在細胞核內miRNA前體在RNA聚合酶的作用下轉錄成pri-miRNA，然后由核酸酶Drosha裂解成pre-miRNA后轉運至細胞質中，在核酸酶Dicer的作用下形成成熟的miRNA，miRNA主要通過與靶基因mRNA的3’UTR結合導致靶基因降解或者抑制靶基因的表達，從而在轉錄后水平阻斷靶基因的表達，在機體的細胞凋亡、細胞增殖、細胞分化及發育等生理過程中發揮重要調節作用。越來越多的研究證實miRNA參與了腫瘤性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、神經系統疾病及其他疾病的病理過程［9-10］。近年來的研究發現miRNA參與了成骨細胞、破骨細胞及軟骨細胞的增殖、凋亡及分化，在骨代謝、骨重建、類風濕關節炎及骨肉瘤等生理病理過程發揮重要作用［19-21］。國內外學者研究發現miR-16、miR-22、miR-34a、miR-146a等在骨關節炎組織中高表達，可能發揮促進骨關節炎作用，而miR-27b、miR-125b、miR-140等在骨關節炎中低表達，可能在骨關節炎過程中起保護作用［11-17］。

miR-365基因定位16p13.12，miR-365的功能非常復雜，目前對miR-365的研究主要是集中在惡性腫瘤，國內外學者研究發現miR-365在結腸癌、肺癌、肝癌、惡性黑色素瘤、兒童白血病、浸潤性導管胰腺癌及胃癌等腫瘤組織或細胞系中表達異常，miR-365在不同腫瘤中可能發揮不同的作用［22-24］。Xu等［17］利用定量PCR檢測發現發現骨關節炎患者軟骨細胞miR-365的表達水平遠遠高于正常的軟骨細胞，同時在大鼠的骨關節炎模型中得到了驗證。外周循環的miRNA可以與蛋白結合成復合體，不易被RNA酶降解，可以非常穩定地存在，體液中miRNA的濃度較高，可以達到作為生物標志物的檢測濃度，同時由于體液取材方便，miRNA是理想的生物標志物［25］。有學者利用定量PCR檢測發現非小細胞肺患者血清中miR-365表達水平明顯降低，與肺癌的轉移及預后有關［23］。目前研究發現miR-16、miR-132、miR-146a、miR-155、miR-223等多種miRNAs在骨關節炎患者血漿或關節滑液中表達異常［26-28］。本研究采用定量PCR檢測了膝骨關節炎患者和膝關節半月板損傷患者血漿和關節滑液中miR-365的表達水平，結果發現膝骨關節炎患者血漿、關節滑液中miR-365水平均明顯高于膝關節半月板損傷患者（P<0.01），與Xu等［17］在骨關節炎的軟骨細胞中的研究結果一致，研究結果提示膝骨關節炎的發病過程中患者血漿及關節滑液中miR-365的水平不斷增高，可能在疾病的病理進程中發揮了一定的作用。研究還發現膝骨關節炎患者血漿中miR-365水平明顯高于關節液中的水平，進一步的相關分析顯示膝骨關節炎患者血漿中miR-365水平與關節滑液中的水平之間呈正相關，提示膝骨關節炎患者血漿、關節滑液中miR-365的來源可能相同，但有關miR-365的具體來源有待于進一步研究。由于膝骨關節炎患者血漿及關節滑液中miR-365可以穩定存在、濃度較高且與病理過程有關，可以作為膝骨關節炎的一種生物標志物。

綜上所述，膝骨關節炎患者血漿、關節滑液中miR-365水平增高，血漿中miR-365水平與關節滑液中的水平之間呈正相關，提示miR-365參與了膝骨關節炎的發生發展過程，隨著對miR-365在膝骨關節炎中的研究深入，miR-365有可能成為膝骨關節炎診斷、預后及治療的新靶點。

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Expression and clinical significances of microRNA-365 in plasm and joint synovia of patients with knee osteoarthritis

YANG Zhi ZHANG Ming LIU Lin PENG Kan XU Peng▲
Department of Joint Surgery，Hong Hui Hospital，Xi'an Jiaotong University College of Medicine，Shaanxi Province，Xi'an710054，China

R684.3

A

1674-4721（2016）09（c）-0103-04

2016-05-20本文編輯：趙魯楓）

陜西省科技計劃項目（2013K12-17-03）；陜西省自然科學基礎研究計劃項目（SJ08-ZT12-6）。