鎘脅迫對2個寧夏主栽水稻品種幼苗期抗氧化同工酶亞基及其活性的影響

黃雪妮　屈凡　馬名立

摘要：為探討2個寧夏主栽水稻品種萌發期、幼苗期對鎘（Cd）脅迫的形態、生理生化響應，明確Cd污染對水稻的傷害機理，并為早期檢測提供理論依據，以富源4號、寧梗28號為研究對象，于人工氣候室內培養，設置3個Cd處理濃度（0、50、100 μmol/L），研究不同處理對水稻發芽率、胚芽鞘長度、胚根數、主根長的影響以及根系中活性氧類（ROS）的累積和細胞凋亡情況；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術分析Cd對4種抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）]同工酶亞基的影響。結果顯示：（1）Cd毒害使根系產生大量活性氧類而誘導根尖伸長區細胞死亡，從而抑制了2個品種主根生長，但卻使根數增加；（2）100 μmol/L Cd抑制了富源4號SOD同工酶亞基，導致SOD總活性下降，CAT活卻顯著性增強；（3）寧梗28比富源4號有較強的耐受Cd的能力。分析結果可知：胚根數的增加是寧夏水稻耐受Cd脅迫的重要措施；Cd脅迫下的SOD活性以及SOD同工酶亞基是可以用來鑒定水稻受重金屬脅迫的一個重要的生理傷害指標；CAT對Cd 脅迫下的水稻起重要的抗氧化保護作用。

關鍵詞：Cd脅迫；水稻；同工酶；活性氧（ROS）；細胞凋亡

中圖分類號： S511.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0107-06

水稻是寧夏平原引黃灌溉區的主要糧食作物之一，也是寧夏平原重要的經濟作物，大面積種植的水稻品種有寧梗系列、富源4號等[1]。但是，隨著黃河沿岸經濟的迅速發展，含有重金屬污染物的工業廢水被排入黃河，導致黃河水質不斷惡化，重金屬污染成為沿黃區水稻種植面臨的重要問題，尤其是重金屬鎘（Cd）作為生物毒性極強的元素，不但在土壤中的化學活性大，而且移動性強、毒性持久。水稻是一種極易富集Cd的農作物，可以將Cd累積在籽粒部位，通過食物鏈的傳遞進入人體。“鎘米”嚴重危及人體健康，能夠致病、致癌、致病變。因此，污染區稻米產品的安全性一直受到重視[2-3]。

目前，關于水稻對Cd的吸收積累途徑、Cd在水稻中的分布規律，及Cd對水稻生長發育的毒害機理等方面已有大量的報道[4-7]，Cd對水稻的生態生理效應趨于成熟。而有研究表明，不同品種的水稻對Cd的耐受性及累積性有顯著差異[4]，種子萌發期既是水稻生活周期的起點，也是水稻感知外界環境的最初生命階段，水稻種子萌發時期的生長狀況直接影響水稻后期的發育和產量。目前，關于Cd在水稻生活周期不同發育階段的效應，尤其是寧夏主栽水稻品種對重金屬Cd響應方面的研究鮮有報道。筆者以寧夏主栽水稻品種寧梗28號、富源4號為研究對象，研究Cd脅迫對這2個品種的萌發率、胚芽鞘長度、主根數、根系中活性氧類（ROS）累積、根系凋亡以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）同工酶的影響，旨在探討重金屬脅迫對寧夏主栽水稻抗氧化同工酶基因表達的影響以及水稻在重金屬脅迫下的抗性差異，為揭示Cd對寧夏主栽水稻品種毒害的生理機理及保障糧食安全和監測重金屬污染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以寧夏主栽水稻品種富源4號、寧梗28號為試驗材料，種子購于寧夏賀蘭縣種子公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻的萌發與處理 挑選大小一致、顆粒飽滿的當年產水稻種子，先用蒸餾水沖洗干凈，后用10%次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min，再用蒸餾水沖洗5次，于25 ℃蒸餾水中浸種4 h，讓種子充分吸脹。取直徑12 cm、鋪有2層消毒濾紙的培養皿，將種子鋪于其中，每個培養皿中均勻擺放30粒種子。對照組（CK）即非脅迫處理，每天加入10 mL滅菌水；Cd處理1每天加入10 mL 50 μmol/L Cd，處理2每天加入10 mL 100 μmol/L Cd，每個處理重復3次。將對照與各處理放置于人工氣候箱中黑暗培養，溫度28 ℃，濕度40%，注意通風。

1.2.2 種子萌發指標的測量 發芽期間，每天定時記錄萌發數（以種子露白為發芽標準），萌發2 d開始測量胚芽鞘長度（mm），每次隨機挑選15粒進行測量，計算平均值。發芽率（GR）即培養3 d時發芽種子數占種子總數的比例（%），萌發5 d后移栽至1/2 Hoagland培養液中，處理濃度不變。

1.2.3 可溶性總蛋白的提取及同工酶電泳 待幼苗生長至10 cm時，各稱取0.5 g幼苗樣品，在冰浴條件下在樣品中加入 2 mL 酶提取液[0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH值8.0（每100 mL含0.073 g半胱氨酸、0.105 g維生素C、20.075 g EDTA-Na、10 mL甘油、5.84 mL 1 mol/L HCl）]，研磨至勻漿，于4 ℃、13 000 r/min離心20 min，上清液即為酶粗提取液，用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量[8]。

同工酶電泳采用北京六一生物科技有限公司生產的垂直板凝膠電泳儀。超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化物酶電泳時采用10%分離膠、5%濃縮膠。抗壞血酸過氧化物酶采用7.5%分離膠、5%濃縮膠。上樣量45 μL，預電泳10 min，濃縮膠中穩定電壓為80 V，進入分離膠后穩定電壓為120 V，電流200 mA。于冰浴中電泳3～4 h后，當指示染料下行至距膠板末端1～2 cm 時停止電泳[9]。

1.2.3.1 同工酶染色及拍照 SOD同工酶的染色采用氮藍四唑同工酶法[10]，POD同工酶染色采用乙酸-聯苯胺法[10]，CAT同工酶染色采用淀粉法[11]，APX同工酶染色參照邵巍等的方法[12]，根據染色的酶譜計算相對遷移率Rf：

Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離。

1.2.3.2 酶活性的測定 SOD活性測定采用氮藍四唑（NBT）法[13]，POD活性測定采用愈創木酚法[14]，CAT、APX活性的測定采用吳倩的方法[15]。每個處理重復3次，所得數據用GraphPadprism 5.0統計軟件進行分析。

1.2.4 根系中ROS的累積及根系凋亡檢測 為了檢測Cd脅迫下水稻根系中ROS的累積隨時間的變化情況，以富源4號的根系為材料。活性氧的檢測：ROS Assay Kit，購自上海碧云天生物技術有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）稀釋成母液后保存于-20 ℃，工作液按1 ∶ 1 000的比例稀釋。以用100 μmol Cd處理0、24、48、72 h的主根根尖為材料，經大量純凈水沖洗干凈后，浸泡于ROS染色液中，于37 ℃溫育20 min；用滅菌去離子水沖洗干凈，裝載于載玻片上，在熒光顯微鏡激發波長為480 nm的條件下觀察活性氧的累積情況，每個處理重復8次。

Cd脅迫下根系細胞凋亡情況用碘化丙錠（PI）檢測：碘化丙啶購自Sigma公司，是一種細胞核染料，能特異穿透死亡細胞的細胞膜而不能穿過活性細胞的細胞膜，從而達到鑒別活細胞的作用。先將PI粉末溶于滅菌水中，配制成濃度為 10 μg/mL 的母液，然后將母液用0.9% NaCl按1 ∶ 100的比例稀釋成工作液。根系處理方法同ROS染色處理，步驟、時間一樣，選取均勻一致的主根，浸泡在工作液中染色大約 3 min，然后用0.9% NaCl溶液沖洗干凈、壓片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，整個過程要求在暗條件下操作，以防熒光猝滅。

2 結果與分析

2.1 結果與分析

2.1.1 水稻種子的萌發率和胚芽鞘長度 表1結果顯示：與CK相比，隨著Cd脅迫濃度的增加，2個品種水稻在處理3 d的發芽率沒有被明顯抑制，甚至Cd處理能在一定程度上促進種子的萌發，寧28的萌發率比富源4號高。培養7 d的主根長、胚根數測量統計結果發現，2個梯度的Cd處理能增加2個品種的胚根數，50 μmol/L Cd能極顯著增加寧梗28根數（P<0.01），富源4號的根數也極顯著增加（P 圖1結果顯示，在非脅迫處理下，寧梗28的胚芽鞘長度比富源4號長，50 μmol/L Cd在一定程度上能促進種子萌發、胚芽鞘生長，但是100 μmol/L Cd卻能夠抑制胚芽鞘生長。寧梗28的胚芽鞘長度比富源4號長，而胚芽鞘長度可以作為抗逆性的形態指標之一[16]，可見與富源4號相比，寧梗28對Cd脅迫有較強的抗逆性。

2.1.2 根系中ROS的累積及細胞凋亡檢測 圖2結果顯示，與對照（CK）相比，100 μmol/L Cd脅迫24 h之后，根尖出現了較強的熒光，說明水稻根系中累積了較多ROS；48 h后檢測發現，根尖中的ROS仍然沒有及時被清除；而72 h之后熒光明顯減弱。同樣，PⅠ染色檢測根尖細胞凋亡的結果顯示，隨著Cd暴露時間的延長，熒光強度明顯增強，在72 h時熒光強度最大。檢測結果顯示，細胞凋亡部位主要發生在根尖分生區、伸長區部位，這可能是導致主根伸長生長被抑制的主要原因。

2.1.3 水稻同工酶電泳及酶活性測定結果

2.1.3.1 Cd對2個品種SOD同工酶及酶活的影響 圖3-a 富源4號同工酶電泳結果顯示，與對照相比，50 μmol/L Cd使SOD亞基出現了8條帶，Rf值分別為0.12、0.23、0.32、0.45、0.57、0.71、0.78、0.84，并且S3、S4、S5亞基的亮度明顯增強。圖3-b酶活測定結果顯示，低濃度Cd能夠使SOD活性極顯著上升（P

2.1.3.2 不同處理對POD的影響 由圖4-a可知，富源4號POD同工酶電泳結果出現7條Rf值分別為0.07、0.21、0.39、0.58、0.61、0.85、0.91的酶帶，隨著Cd2+濃度的增加，富源4號POD亞基條帶數沒有變化，P4亞基的亮度稍有增加。同步酶活測定結果顯示，Cd濃度的增加并沒有顯著性引起POD活性的變化（圖4-b）。圖4-c寧28的POD同工酶電泳結果也顯示有7條酶帶，P4亞基隨著Cd2+濃度的增大而逐漸加深；POD活性沒有顯著性的變化（圖4-d）。

這一結果表明，在Cd脅迫早期，POD并沒有起到明顯的抗氧化保護作用，有研究認為，POD很有可能是植物受到傷害的一個重要的生理傷害指標，是植物體內H2O2過度累積的一個重要標志。因此推測，可能水稻體內的H2O2暫時沒有過度累積，因此POD活性沒有顯著上升。

2.1.3.3 Cd處理對水稻CAT的影響 不同濃度的Cd脅迫處理后，富源4號CAT同工酶圖譜顯示3條酶譜帶，Rf值分別為0.12、0.18、0.29，C1、C3的亮度逐漸加大、條帶加寬（圖5-a）；由圖5-c可知，寧梗28同工酶電泳結果也顯示3條帶，C2、C3亞基的亮度隨著Cd濃度的增大而增強。酶活測定結果顯示，100 μmol/L Cd脅迫都能使CAT活性極顯著上升（P<0.01）（圖5-b、圖5-d）。這一結果表明，CAT在Cd脅迫下并沒有被抑制，可能在抗氧化保護系統中起到比較重要的作用。

2.1.3.4 不同Cd濃度對水稻APX的影響 由圖6-a、圖6-b可見，富源4號的APX活性無明顯變化，100 μmol/L Cd使A7亞基亮度降低。由圖6-c、圖6-d可見，寧梗28的APX在100 μmol/L Cd脅迫下條帶亮度稍有增強， 但是在酶

活性上沒有明顯差異。這些結果說明，在脅迫早期，APX對Cd的響應不明顯。

3 討論

關于Cd對種子萌發及幼苗生長方面的影響已經有大量報道，楊穎麗等研究發現，低濃度Cd對種子萌發有一定的促進作用[17]，本研究結果與之相似，這可能是由于萌發初期Cd對淀粉酶活力略有提高作用，從而促進了細胞分裂[18]。而高濃度Cd對主根伸長生長的顯著抑制作用可能與Cd進入細胞之后導致細胞分裂出現障礙或不正常分裂[19-20]、根系中ROS的過量累積而導致根尖細胞死亡有重要關系，說明Cd脅迫對水稻根系發育及胚芽生長有明顯抑制作用，而寧梗

28、富源4號對Cd脅迫的一個重要形態響應就是增加胚根數。

抗氧化同工酶是植物體內最活躍的酶系之一，逆境脅迫可以調節同工酶基因在不同水平上表達，不良的環境因素常常引起基因的變異而導致酶結構的改變，這種改變反映在同工酶的酶譜上出現了不同數量、不同遷移率的譜帶，因此同工酶的表達是遺傳因子與環境因子共同作用的結果。通過對抗氧化同工酶的分析，可以初步了解寧夏水稻品種對不良環境的響應。當Cd被吸收進入水稻體內之后，刺激產生有害的過氧化物，當脅迫發生后，水稻體內的過氧化物酶系統會被激活起到保護作用；但當脅迫發生超過水稻忍受極限時，其防御措施也就相應減弱，乃至死亡。SOD第1個參與 O-2 · 的清除反應，生成H2O2、O2，在抗氧化酶類中處于重要地位。SOD活性的高低可以在一定程度上反映植物抗逆本領的強弱[21-22]，Liu等研究表明，日本忍冬具有較強的富集重金屬Cd的能力，經檢測發現，在重金屬脅迫下忍冬體內具有較高的SOD活性[23]。而本試驗結果表明，2個寧夏水稻在遭受Cd脅迫后，SOD同工酶基因在譜帶數、表達量上都發生了明顯的變化，SOD同工酶S3、S4亞基基因的被抑制效應，導致SOD活性在高濃度Cd脅迫下極顯著地被抑制，因此推測SOD在Cd脅迫下不能起關鍵的抗氧化保護作用，活性氧代謝系統失調的主要產物可能為H2O2，而非 O-2 · 。

CAT在重金屬抗性方面起到重要作用，能夠高效地分解H2O2為H2O、O2而不需要消耗任何物質，因此能積極地響應體內H2O2累積，從而避免H2O2從過氧化物酶體擴散至細胞而造成氧化毒害。在煙草中已經發現了CAT基因編碼的3種蛋白質用來清除體內產生的H2O2[24]。筆者研究發現，在SOD被抑制的情況下，CAT活性卻在顯著上升，CAT同工酶隨著Cd濃度的升高，出現新的酶條帶亞基，可能在后期將 O-2 · 、H2O2清除，從而最大限度地減少HO-的形成。

由于ROS的累積與POD的活性呈顯著線性關系，MacFarlane等將POD活性的上升認為是遭受重金屬脅迫的一個重要的指標[25]。本研究表明，在Cd脅迫早期，無論是同工酶電泳還是酶活檢測，結果都顯示POD沒有明顯改變，因此推測水稻幼苗中的H2O2物質未累積的較多，導致酶活基本未變。在本試驗中，早期POD沒有明顯變化，可能與脅迫程度和CAT對ROS的積極清除有關。

4 結論

（1）Cd對水稻根系毒害主要表現在根系中ROS的累積、根尖伸長區細胞的凋亡以及根系生長被抑制，而寧夏水稻根系適應Cd脅迫的一個重要措施就是增加胚根數。（2）SOD亞基S3、S4的被抑制效應，是導致SOD活性下降的主要原因，因此Cd脅迫下SOD活性以及SOD同工酶是可以用來鑒定水稻受重金屬脅迫的一個重要的生理傷害指標。（3）CAT在寧夏水稻清除Cd誘導的過氧化損傷中起到重要的作用。

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