Akt在FGF21預防糖尿病心肌病中的作用研究

張芳芳，林秀飛，陳聰聰，何露清，張馳，蔡露

（溫州醫科大學　藥學院　中美糖尿病并發癥研究所，浙江　溫州　325035）

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Akt在FGF21預防糖尿病心肌病中的作用研究

張芳芳，林秀飛，陳聰聰，何露清，張馳，蔡露

（溫州醫科大學藥學院中美糖尿病并發癥研究所，浙江溫州325035）

目的：探索成纖維細胞生長因子21（FGF21）對糖尿病心肌病（DCM）的預防作用；解析Akt信號途徑是否是介導FGF21心肌保護作用的分子機制。方法：在雄性C57BL/6J小鼠中構建2型糖尿病模型，成模后給予FGF21腹腔注射干預6個月。檢測心臟功能后處死小鼠收集小鼠心臟組織。對各組小鼠心肌肥大、心臟纖維化及細胞凋亡等損傷指標進行檢測。隨后分離小鼠原代心肌細胞，利用高糖/高脂（HG/Pal）處理細胞模擬2型糖尿病內環境，同時給予FGF21干預及Akt2-siRNA干預39 h，檢測FGF21對心肌細胞肥大、凋亡及纖維化改變的影響。結果：體內實驗顯示FGF21干預能顯著改善糖尿病誘導的心臟功能紊亂，抑制心臟病理損傷，改善心肌肥大、心臟纖維化改變（P＜0.05）。體外研究成功模擬了2型糖尿病誘導的心肌細胞損傷，同時驗證了FGF21對HG/Pal環境下心肌細胞的保護作用，證實了抑制Akt的表達及活性能完全阻斷GF21對心肌細胞的保護作用。結論：FGF21對糖尿病誘導的心肌損傷具有保護作用，而Akt信號途徑是介導FGF21心肌保護作用的關鍵機制。

成纖維細胞生長因子21；糖尿病心肌?。恍呐K功能；Akt；HG/Pal

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是獨立于冠心病、高血壓等因素而由糖尿病作為唯一誘因的心臟疾?。?］，臨床表現為早期心臟舒張功能不全，晚期收縮功能不全，最終導致心臟功能衰竭。DCM的病理特征包括心肌肥大、心室壁增厚、心臟纖維化改變、膠原沉積、基質增加、肌絲斷裂以及心臟功能紊亂等。DCM作為糖尿病最主要的并發癥之一，嚴重威脅著糖尿病患者的生命健康。成纖維細胞生長因子（fiborblast growth factor，FGF）-21是FGF家族新近發現的重要成員，其在代謝調節方面發揮著重要的作用。研究表明，FGF21能顯著降低2型糖尿病小鼠體質量、血糖和血脂水平，促進血糖重吸收，維持β細胞的數量和功能。與胰島素相比，FGF21具有過量不導致低血糖的優點。另外FGF21不具備FGF家族經典的促有絲分裂活性，徹底消除了人們對于FGF21致瘤性的擔憂，使得FGF21體內用藥治療糖尿病成為可能。FGF21不僅能通過調節糖脂代謝有效抑制糖尿病的發展，針對于多種糖尿病并發癥FGF21也表現出了明顯的抑制作用［2-8］。因此本研究探索FGF21對DCM的預防作用，解析Akt信號途徑是否是介導FGF21心肌保護作用的分子機制。

1　材料和方法

1.1實驗動物及分組 8～10周齡雄性C57BL/6J小鼠32只（購于北京農科院動物所）隨機分為以下幾組：正常對照組（Con）、FGF21給藥組（FGF21）、糖尿病組（DM）、糖尿病FGF21給藥組（DM/FGF21）。根據組別分別給以高脂飼料和正常飼料喂養12周。喂養12周后禁食12 h，DM組、DM/FGF21組和Con組、FGF21組分別給予腹腔一次性注射小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）50 mg?kg-1或等量枸櫞酸緩沖液。注射3 d后，檢測隨機血糖，血糖≥12 mmol?L-1視為2型糖尿病模型小鼠。成模后DM/FGF21組小鼠給予FGF21（100 μg?kg-1?d-1）腹腔注射6個月。檢測心臟功能后處死取心臟組織，檢測心肌肥大、心肌細胞凋亡及纖維化情況。

1.2心臟功能檢測 采用高效超聲檢測儀（Echo）檢測各組小鼠心臟功能，主要檢測指標包括舒張期左心室內徑（LVID；d）、收縮期左心室內徑（LVID；s）、舒張期室間隔厚度（IVS；d）、收縮期室間隔厚度（IVS；s）、舒張期左心室后壁厚度（LVPW；d）、收縮期左心室后壁厚度（LVPW；s）、射血分數（EF）、左室短軸縮短率（FS）、左心室質量（LV mass）和修正后的左心室質量（LV mass-C）。

1.3小鼠原代心肌細胞培養及處理 小鼠腹腔注射0.5 mL肝素（100 U?mL-1），異氟烷麻醉取出心臟，立即置于裝有10 mL灌流緩沖液（含113 mmol?L-1NaCl、4.6 mmol?L-1KCl、0.6 mmol?L-1KH2PO4、1.2 mmol?L-1MgSO4?7H2O、12 mmol?L-1NaHCO3、10 mmol?L-1KHCO3、10 mmol?L-1HEPES、30 mmol?L-1Taurine、10 mmol?L-1BDM、5.5 mmol?L-1glucose）的60 mm培養盤中，在1 min內將心臟主動脈套在langendorff灌流套管上，立即灌流，流速（3 mL?min-1）×4 min，然后轉化至心肌細胞消化緩沖液中（在灌流緩沖液中加入CollgenaseI I 1 mg?mL-1、CaCl2100 mmol?L-1），消化8～10 min（3 mL?min-1）至心肌組織變軟，并呈白色半透明，立即終止消化，剪下心室組織，置于60 mm含有2.5 mL消化液的培養盤中，輕輕撕裂心肌組織，并用一次性移液管輕輕吹打數次（此過程需在90 s內完成，然后將細胞懸液轉入還有2.5 mL消化終止液［灌流緩沖液中加入小牛血清（BCS，10%）、CaCl2100 mmol?L-1］的15 mL離心管中，然后分別用2.0 mm、1.5 mm、1.0 mm直徑移液管逐步分散心肌細胞，此過程需在3～5 min內完成。隨后逐步完成復鈣過程，最終得到桿狀心肌細胞通常＞80%，方可以用于后續實驗研究。細胞實驗分為4組：正常對照組（Con）、FGF21給藥組（FGF21）、高糖高脂處理組（HG/Pal）、高糖高脂FGF21處理組（HG/Pal/FGF21）。待細胞融合長成單層時，更換為無血清培養基使細胞生長同步化。24 h后向FGF21組和HG/Pal/FGF21組細胞培養液中加入FGF21（50 ng?μL-1，溫州醫科大學藥學院提供）預處理2 h，隨后給予HG/Pal/FGF21組細胞高糖（33 mmol?L-1）和棕櫚酸（62.5 μmol?L-1，Sigma-Aldrich Chemical Co.美國）處理，2組細胞同時給予FGF21處理15 h后收集細胞，提取蛋白用于后續檢測。

1.4siRNA技術 按1.3中操作培養小鼠原代心肌細胞，當細胞達到70%融合時，應用Lipofectamine2000轉染試劑將siRNA轉染到細胞中，轉染濃度為10 nmol?L-1，轉染時間為48 h，轉染后細胞可用于相應研究。

1.5Western Blot檢測 每組小鼠取心臟組織100 mg，加入1 000 μL RIPA裂解液，蛋白含量測定，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，抗體孵育，顯影。對心肌肥大指標心鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC），纖維化指標結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），Akt信號通路相關蛋白Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）、TRB3、蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase-1B，PTP1B）和細胞凋亡指標Cleaved Caspase-3（C-Cas3）的表達水平進行檢測。其中一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司，濃度均為1∶1 000；二抗均購自美國Santa Cruz公司，濃度均為1∶2 000。Quantity one軟件進行灰度測量，以目的蛋白與內參蛋白的灰度比值作為蛋白相對表達量。

1.6組織病理檢測

1.6.1組織標本采集與處理：小鼠心臟組織用10%甲醛固定24 h后，石蠟包埋，切成4 μm厚切片，置于多聚賴氨酸處理的載玻片上，60 ℃烤干4～6 h備用。

1.6.2HE染色：烤片完畢后，二甲苯I 10 min，二甲苯I I 15 min，無水乙醇5 min，95%乙醇5 min，75%乙醇5 min，自來水或蒸餾水泡30 min，進入蘇木素溶液7 min，自來水沖洗，5%醋酸-乙醇溶液分化20～30 s，浸入伊紅溶液3 min，95%酒精脫水45 s，100%乙醇脫水2 min，二甲苯I浸5 min，二甲苯I I 浸10 min，趁二甲苯未干時，中性樹膠封片，觀察，拍片。主要檢測心肌結構改變。

1.6.3Sirius-red染色：烤片完畢后，天青石藍液染5～10 min，蒸餾水洗3次，天狼星紅飽和苦味酸液染15～30 min，直接用無水乙醇分化與脫水，95%酒精脫水45 s，100%乙醇脫水2 min，二甲苯I浸5 min，二甲苯 II浸10 min，趁二甲苯未干時，中性樹膠封片，觀察，拍片。主要檢測心肌組織纖維化改變。

1.7統計學處理方法 采用SPSS16.0進行統計學分析。實驗結果以±s表示，統計分析多重（組）比較采用單因素或者雙因素Post-hoc多重比較，Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1FGF21干預改善糖尿病小鼠心臟功能紊亂 結果顯示DM組小鼠舒張期左心室內徑（LVID；d）、收縮期左心室內徑（LVID；s）、舒張期室間隔厚度（IVS；d）、舒張期左室后壁厚度（LVPW；d）、收縮期左室后壁厚度（LVPW；s）均顯著升高（P＜0.05），收縮期室間隔厚度（IVS；s）顯著降低（P＜0.05）。同時反映心臟功能的關鍵指標EF及FS也顯著降低（P＜0.05），表明2型糖尿病患病后6個月已經出現心臟功能紊亂，但給予FGF21干預能顯著改善上述心臟功能指標，維持心臟功能的發揮。見表1。

表1　FGF21對DCM小鼠心臟功能的影響（n=8，±s）

表1　FGF21對DCM小鼠心臟功能的影響（n=8，±s）

與Con組比：aP＜0.05；與DM組比：bP＜0.05

組別　LVID；d（mm）LVID；s（mm）IVS；d（mm）IVS；s（mm）LVPW；d（mm）LVPW；s（mm） EF（%） FS（%）　LV mass（mg） LV mass-C（mg）Con　3.64±0.21　1.65±0.15　0.71±0.06　1.15±0.06　0.85±0.03　1.82±0.14　86.21±1.66　61.33±1.1691.54±2.46　75.15±1.77 FGF21　3.61±0.32　1.62±0.21　0.73±0.05　1.14±0.08　0.82±0.02　1.81±0.11　88.23±1.12　61.63±1.0190.43±1.58　75.36±1.26 DM　4.08±0.27a　2.25±0.15a0.84±0.05a　0.81±0.04a1.26±0.09a　1.34±0.12a 61.49±1.52a　41.42±1.17a　111.57±1.44a　89.53±2.54aDM/FGF21 3.71±0.15ab1.91±0.17b0.72±0.02b　1.12±0.06b0.90±0.05ab1.64±0.11ab76.82±1.04ab55.02±1.03ab100.64±2.42ab83.41±1.22ab

2.2FGF21干預抑制糖尿病導致的心臟肥大 研究結果表明糖尿病小鼠心臟絕對重量顯著增加，表現為心臟重量/脛骨長度比值（Heart/Tibia）顯著增加（P＜0.05，見圖1A），同時在糖尿病小鼠心臟中心肌肥大關鍵指標ANP（P＜0.05，見圖1B）、BNP（P＜0.05，見圖1C）及β-MHC（P＜0.05，見圖1D）表達均明顯升高，表明患病后6個月糖尿病小鼠出現了明顯的心肌肥大。這一改變在給予了FGF21干預后被顯著抑制，表明FGF21對糖尿病誘導的心肌肥大具有預防作用。

2.3FGF21干預抑制糖尿病導致的心臟組織結構損傷 研究結果表明，Con組小鼠心肌纖維排列整齊，細胞核呈長梭狀，位于心肌纖維中部，間質無明顯擴增，未見炎癥細胞浸潤；DM組小鼠心臟纖維排列紊亂，存在明顯的肌絲斷裂，間質擴大并存在水腫現象，可見明顯的炎癥細胞浸潤現象及脂肪變性空泡；上述病理損傷在給予FGF21干預后被顯著改善（見圖2），表明FGF21在糖尿病狀態下對小鼠心臟結構具有保護作用。

2.4FGF21干預抑制糖尿病導致的心臟纖維化改變

Sirius-red染色結果顯示與Con組及FGF21組相比糖尿病小鼠膠原沉積陽性染色顯著增加（P＜0.05，見圖3A、B），且主要附著在心臟與血管的連接部位。同時糖尿病小鼠心臟中纖維化經典指標CTGF（P＜0.05，見圖3C）及TGF-β表達（P＜0.05，見圖3D）顯著增加，表明2型糖尿病小鼠患病6個月后心臟出現明顯纖維化改變。上述纖維化改變在給予FGF21干預后被顯著抑制（P＜0.05）。

2.5FGF21干預激活心臟中Akt/GSK3β信號通路

研究結果表明，糖尿病小鼠心臟中Akt信號通路收到明顯抑制，表現為Akt及GSK3β磷酸化水平降低（見圖4A、B），同時Akt的另外2種負反饋調節蛋白TRB3及PTP1B表達顯著升高（見圖4C、D），給予FGF21干預后能顯著抑制糖尿病小鼠心臟中Akt及GSK3β的去磷酸化（見圖4A、B），同時降低TRB3及PTP1B的表達（見圖4C、D），說明FGF21可能是通過抑制了Akt負反饋調節蛋白的表達從而改善糖尿病狀態下心臟中Akt信號通路的強度。

圖1　FGF21干預對2型糖尿病小鼠心肌肥大的影響

圖2　FGF21對糖尿病小鼠心臟組織結構的影響（HE，×40；箭頭示肌絲斷裂，肌纖維排列紊亂 ）

2.6Akt介導FGF21對心肌細胞的保護作用 研究結果表明HG/Pal處理后能顯著誘導心肌細胞肥大，表現在ANP（見圖5D）、BNP（見圖5E）及β-MHC表達（見圖5F）的增加；同時導致心肌細胞纖維化改變，表現在CTGF（見圖5G）及TGF-β（見圖5H）表達增加；另外我們還檢測到心肌細胞凋亡的增加，表現在CCas3表達增加（見圖5I）。上述數據表明本研究已經在體外成功模擬了DCM導致的心肌細胞損傷。上述損傷在給予FGF21處理后顯著改善，與體內研究結果一致。進一步研究發現，利用siRNA技術沉默Akt2表達能完全抑制HG/Pal環境下FGF21誘導的心肌細胞作用，表明Akt2介導了FGF21在HG/Pal環境下的心肌細胞保護作用（見圖5）。

3　討論

心血管并發癥是糖尿病最主要的致死原因之一。成年人中糖尿病患者并發心血管系統疾病的比例是正常人群的4倍。而DCM是糖尿病誘導的心血管系統疾病的重要組成部分。DCM是以心臟舒張/收縮功能紊亂、心臟結構改變（纖維化及心室重構）為主要特征［9-10］。糖尿病狀態下，糖脂毒性首先會造成心臟細胞凋亡，死亡的心肌細胞會被細胞外基質及纖維細胞填充，降低了心臟收縮/舒張功能。心臟通過代償性增厚的方式維持心臟功能。早期的的心肌肥厚對心臟功能具有保護作用，但當心肌肥厚發展超過心臟負荷時便會造成心臟損傷，導致心臟功能紊亂，最終造成心臟功能衰竭［11-13］。因此心肌細胞凋亡-心室重構-心臟功能紊亂是DCM發生發展的3個主要階段［14］。針對上述3點進行藥物開發將能在很大程度上防治DCM的發生與發展。

圖3　FGF21對糖尿病小鼠心臟纖維化改變的影響（×40）

圖4　FGF21對糖尿病小鼠心臟中Akt信號通路的影響

圖5　Akt2在FGF21誘導的心肌細胞保護中發揮作用

在前期研究中我們發現，外源FGF21干預能顯著預防1型糖尿病早期誘導的心肌細胞凋亡；與WT小鼠相比，FGF21-KO小鼠心臟中1型糖尿病誘導的心肌細胞凋亡水平進一步加?。?］，表明內源性FGF21在糖尿病狀態下也能發揮抗心肌細胞凋亡作用。既然前期研究證實了FGF21對于1型糖尿病小鼠心肌細胞凋亡的抑制作用，那么FGF21是否也能預防糖尿病后期誘導的心室重構及心臟功能紊亂，從而抑制DCM的發展是本研究要回答的問題。由于流行病學研究顯示，臨床糖尿病患者中2型糖尿病占主體，而且2型糖尿病導致的DCM致死率更高［15-16］，因此在本課題中我們利用HFD/STZ方法處理小鼠制備2型糖尿病模型開展研究。成模后給予小鼠FGF21處理6個月。大量研究［12-13，17］發現在2型糖尿病小鼠患病6個月后會出現明顯的DCM癥狀，因此本研究選擇此時間點作為檢測點。結果證實2型糖尿病患病后6個月小鼠心臟功能出現明顯紊亂，表現在EF及FS顯著降低。而上述心臟功能紊亂現象在DM/FGF21組被明顯抑制，表明FGF21干預能顯著改善糖尿病后期誘導的心臟功能紊亂。由于心室重構是導致心臟功能紊亂的主要誘因，因此在本研究中我們也針對心室重構的2個組成部分—心肌肥大及纖維化進行了檢測。結果顯示FGF21干預也能顯著抑制2型糖尿病后期誘導的心肌肥大和心臟纖維化改變，同時對于心臟結構的病理改變，FGF21也有明顯的保護作用。

作為經典的FGF家族成員，FGF21生物學功能的發揮是通過激活其下游信號轉導通路而實現的。研究表明ERK1/2、AMPK及Akt都是FGF21下游信號途徑中的關鍵激酶［18-22］。在前期研究中我們利用體外及體內實驗證實了FGF21通過激活糖尿病小鼠心臟中ERK1/2-p38 MAPK-AMPK信號通路，從而抑制PTEN活性最終發揮抗心肌細胞凋亡作用。由于PTEN 是Akt活性負調控蛋白，因此Akt可能是在早期糖尿病狀態下介導FGF21抗心肌細胞凋亡作用的關鍵激酶。在本研究中我們發現FGF21能顯著改善2型糖尿病小鼠心臟中的Akt信號通路。因此機制探索方面我們將重點解析Akt在FGF21誘導的DCM預防作用中所承擔的角色。我們利用HG/Pal處理小鼠原代心肌細胞模擬2型糖尿病體內環境，同時給予FGF21干預。研究結果顯示HG/Pal環境下，心肌細胞中細胞凋亡、細胞肥大以及纖維化改變等蛋白指標都顯著升高，表明我們在體外成功模擬了DCM造成的心肌細胞損傷。隨后研究證實FGF21干預能顯著預防上述心肌細胞的損傷。但該保護作用在給予Akt2 siRNA處理后被完全阻斷，表明Akt2及其信號通路介導了HG/Pal環境下FGF21誘導的心肌細胞保護作用，提示Akt是介導FGF21預防DCM的關鍵激酶。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Study on the role of Akt signaling in FGF21-induced prevention on diabetic carodiomyopathy

ZHANG Fangfang, LIN Xiufei, CHEN Congcong, HE Luqing, ZHANG Chi, CAI Lu. The Sine-American Research Intitute for Diabetic Complications, College of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 25035

Objective: To explore the role of fi broblast growth factor 21 （FGF21） on diabetic cardiomyopahy and analyze the role of Akt signaling in FGF21-induced prevention on diabetic carodiomyopathy. Methods: Male C57BL/6J mice were allowed to establish mouse model of type 2 diabetes. Diabetic mice were randomly elected for the treatment of FGF21 for 6 months. Heart tissues were obtained for detection of histopathological hanges， cardiomyocyte hypertrophy， fi brosis index and apoptosis after heart functions were detected. Isolation nd culture of primary myocardial cell in mice， high glucose/lipid （HG/Pal） treatment of cells to simulate the enironment in type 2 diabetes mellitus， at the same time， FGF21 and Akt2-siRNA intervention were given for 39 ours to detect the change of cardiomyocyte hypertrophy， apoptosis and fi brosis. Results: It was demonstrated in ivo study that FGF21 could signifi cantly alleviate heart structural changes， dysfunction， cardiomyocyte hyperrophy and fi brosis induced by type 2 diabetes （P＜0.05）. It was verifi ed in vitro study demonstrated that FGF21 ould upregulate Akt phosphorylation level， activation of Akt and downstream signaling pathways， inhibit the ctivity of Akt， abate FGF21 protection of myocardial injury. Conclusion: FGF21 plays a protective role in diaetes-induced myocardial injury， and Akt signaling is a key mechanism in FGF21-induced myocardial protection.

fi borblast growth factor-21； diabetic cardiomyopathy； cardiac function； Akt； HG/Pal

R541.9；Q591.9

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.004

2016-02-23

國家自然科學基金資助項目（81370917）。

張芳芳（1991-），女，浙江瑞安人，碩士生。

蔡露，教授，Email：541562914@qq.com。