凋亡誘導因子在阿爾茨海默病患者大腦中的表達及意義*

楊　梅, 任真奎, 禹文峰, 官志忠

(貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽　550004)

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·專題研究·

凋亡誘導因子在阿爾茨海默病患者大腦中的表達及意義*

楊梅, 任真奎, 禹文峰**, 官志忠

(貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽550004)

目的： 了解凋亡誘導因子(AIF)在阿爾茨海默病患者(AD)腦組織中的表達及亞細胞分布。方法： 7例AD患者(AD組)和7例正常老年人(對照組)大腦組織標本，采用免疫組織化學染色法，記錄并比較被檢腦組織海馬CA1、CA2、CA3、DG、內嗅皮質淺層(EC Ⅰ～Ⅲ)和深層(EC Ⅳ～Ⅵ)以及顳葉淺層(TC Ⅰ～Ⅲ)和深層(TC Ⅳ～Ⅵ)區AIF蛋白陽性表達細胞數，計算AIF總評分和AIF核轉移分比。結果： 與對照組比較，AD組AIF蛋白在海馬CA1、DG以及ECⅠ～Ⅲ區表達顯著升高(P<0.05)，在海馬CA2、CA3、EC Ⅳ～Ⅵ及TC Ⅳ～Ⅵ區的表達無明顯變化(P>0.05)；AD組AIF細胞核轉移分比在海馬的CA1、CA2、CA3、DG區，內嗅皮質和顳葉皮質均顯著高于對照組(P<0.05)。結論： AIF的細胞核轉移可能是AD患者大腦中發生神經細胞凋亡的重要病理因素之一。

阿爾茨海默病； 腦； 海馬； 細胞凋亡； 凋亡誘導因子

[Abstract]Objective: To explore the expression and subcellular distribution of apoptosis inducing factor(AIF) in the brain of patients with Alzheimer's disease(AD). Methods: Brain tissue were collected from 7 cases of AD patients(AD group) and 7 cases of healthy old people as controls(control group). Immunohistochemical staining was adopted to record the cell number of AIF protein positive expression in hippocampal CA1, Ca2, CA3 and DG area, in entorhinal cortex shallow layer (EC Ⅰ～Ⅲ) and deep layer(EC Ⅳ～Ⅵ) and temporal lobe shallow layer (TC Ⅰ～Ⅲ) and deep layer (TC Ⅳ～Ⅵ). The AIF total score and AIF nuclear transfer ratio were calculated and compared between the two groups. Results: Compared with control group, AIF expression in hippocampal CA1, DG and EC Ⅰ～Ⅲ area increased significantly in AD group(P<0.05) while AIF expression showed no significant change in CA2, CA3, EC Ⅳ～Ⅵ and TC Ⅳ～Ⅵ area in AD group(P>0.05). Compared with control group, AIF nuclear transfer ratios in hippocampal CA1, Ca2, CA3, DG area, entorhinal cortex layer and temporal lobe layer were significantly higher in AD group (P<0.05). Conclusion: The nuclear transfer of AIF may be one of the important pathological factors of neuronal apoptosis in the brain of AD patients.

[Key words]Alzheimer's disease; brain； hippocampus； apoptosis; apoptosis-inducing factor

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以進行性記憶和認知功能障礙為特征的中樞神經系統退行性疾病(Re),主要病理變化有大腦老年斑(senile plaque, SP)、神經纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)以及大量神經細胞丟失[1]。神經細胞丟失有凋亡、壞死和自噬3種方式，而AD大腦中神經細胞的丟失，則以凋亡為主[2]。細胞凋亡有2條途徑，一條需要Caspase和Bcl家族參與，稱為Caspase依賴性細胞凋亡；另一條不依賴于Caspase，稱為非Caspase依賴性細胞凋亡。目前，對Caspase 依賴性細胞凋亡通路的分子機制已經有了比較明確的認識，但對非Caspase依賴性細胞凋亡通路的分子機制尚不明確。凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)是首個被發現的非Caspase依賴性細胞凋亡通路的執行分子，它在各種組織中廣泛表達。研究證實，AIF的異常表達與諸多疾病均有相關性[3～8]。在正常生理條件下，AIF局限在線粒體膜，僅在線粒體表達；但在病理條件下，AIF從線粒體內膜上代償性釋放并轉移至細胞核內，在細胞核內表達，出現AIF核轉移。關于AIF在AD中的表達鮮有報道，其參與神經元細胞凋亡的具體機制亦不明確，本研究通過檢測AD患者腦組織中AIF的表達情況，研究AIF和AD病理變化間的關系。

1　材料與方法

1.1樣本

本研究得到加拿大魁北克省麥吉爾大學附屬道格拉斯神經研究所倫理研究委員會的批準，人腦組織來源于加拿大魁北克腦庫，已完成前期處理和Braak分期。患者死亡后運送至魁北克腦庫尸檢取樣，左半球冰凍切成5 mm厚片， -80 ℃保存，右半球福爾馬林固定，再分離海馬、內嗅皮質、顳葉進行石蠟包埋備用。

1.2方法

1.2.1分組將7例AD病人的腦組織標本作為AD組，7例正常老年人的腦組織標本作為對照組。AD組男性5例，女性2例，年齡71～92歲，死亡到尸檢時間(PMI)7.5～32 h，病人具有典型的神經病理學損害，Braak分期β-淀粉樣蛋白聚集為C階段，神經纖維的纏結為Ⅱ～Ⅵ；對照組男性3例，女性4例，年齡60～85歲，PMI為7.25～32.75 h，無癡呆病史，無腦神經病變，無完整的β-樣淀粉蛋白聚集斑塊和神經纖維的纏結。2組被檢者性別、年齡和PMI比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2.2免疫組織化學染色取海馬、內嗅皮質、顳葉部位的組織石蠟包埋塊，每個部位選取5個區域，連續做10張切片，并標明序號。脫蠟，TBS(Tris-HCl緩沖鹽溶液)漂洗3次，5 min/次，滴加1%過氧化氫孵育30 min，以清除內源性過氧化物酶的活性。TBS漂洗3次，5 min/次，再放入煮沸的0.05 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中修復抗原。TBS漂洗3次，5 min/次，10%的山羊血清室溫下封閉1 h，取相鄰兩張切片分別孵育一抗，用TBS做一張陰性對照，其他相鄰的兩張切片分布孵育1∶1 000的AIF兔抗人多克隆抗體(氨基酸593～613，Sigma,美國)以及1∶500的鼠單克隆抗NeuN抗體(Millpore，美國)，4 ℃冰箱內孵育過夜(14～18 h)。TBS漂洗3次，5 min/次，滴加1∶200的二抗，羊抗兔或羊抗鼠IgG(Vector，美國)，室溫下孵育60 min，TBS漂洗3次，5 min/次,滴加已放置30 min的ABC復合物反應30 min，TBS漂洗3次，5 min/次,根據說明書加入DAB液(Vector，美國)顯色3 min。蒸餾水沖洗5 min后，乙醇70%，90%，100%分別脫水5 min，二甲苯透明3次，1 min/次，中性樹膠封片。

1.2.3結果判定通過數碼相機連接Nikon Eclipse800顯微鏡獲取圖像。拍攝海馬的CA1、CA2、CA3和DG、內嗅皮質(entorhinal cortex，EC)淺層(EC Ⅰ～Ⅲ)和深層(EC Ⅳ～Ⅵ)區以及顳葉(Temporal cortex，TC)淺層(TC Ⅰ～Ⅲ)和深層(TC Ⅳ～Ⅵ)區，參照文獻[9]方法每個區域選取5個陽性區進行圖像采集，用Image j軟件計數AIF在不同位置表達的細胞數，計算AIF總評分和AIF核轉移的百分比。(1)AIF總評分：按照文獻[10-11]進行染色程度評分和AIF陽性細胞百分比評分，染色程度評分為未檢測到AIF表達定義為0分，切片中AIF陽性細胞免疫染色低、中、強定義為1、2及3分；AIF陽性細胞百分比評分為切片AIF陽性細胞數量/相鄰切片相應位置NeuN染色的神經元數量=AIF陽性細胞百分比，百分比0%～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3，76%～100%為4分；染色程度評分×AIF陽性細胞百分比評分，為0～12的AIF總評分。(2)AIF核轉移的百分比=切片上細胞核染色陽性神經細胞數目/AIF細胞染色陽性的總數。

1.3統計學分析

2　結果

2.1AIF評分

AIF主要在人腦組織的神經元細胞中表達。與對照組比較，AD組海馬的CA1、DG以及EC Ⅰ～Ⅲ區，AIF評分顯著升高(P<0.05)，在海馬CA2、CA3、EC Ⅳ～Ⅵ以及TC Ⅳ～Ⅵ區的表達無明顯變化(P>0.05)。見圖1、表1。

表1　兩組被檢者海馬、內嗅皮質及顳葉皮質的AIF評分

2.2AIF核轉移百分比

與對照組比較，AD組在海馬CA1、CA2、CA3、DG、EC和TC的AIF細胞核轉移百分比升高(P<0.05)，見圖2和表2。

表2　兩組被檢者海馬各區、EC及TC的AIF核轉移百分比

3　討論

AD的主要病理變化是神經細胞外β-淀粉樣蛋白聚集形成的老年斑，胞內Tau蛋白異常磷酸化形成的神經纖維纏結，以及顳葉和海馬等部位大量神經元細胞丟失等。神經元細胞丟失到一定程度，便會損傷腦的功能[12]。大量的尸檢報告中均發現AD腦組織中有明顯的神經細胞凋亡現象。神經元細胞喪失在海馬的CA1區達20%，在海馬回中的EC達50%～60%，大腦TC處達50%[13]。AIF是一種具有凋亡誘導活性的蛋白質，其前體蛋白分子量為67 kDa，AIF成熟蛋白是分子量大小為62 kDa位于鑲嵌在線粒體內膜的蛋白[14-15]。在正常生理條件下，AIF局限在線粒體膜之間，擁有核黃素結合域而具有氧化還原酶活性，可與FAD結合，參與氧化還原和清除呼吸機相關產生的自由基[16]。而在病理條件下，由于線粒體外膜病理通透性，成熟AIF進一步通過激活鈣蛋白酶和/或組織蛋白酶加工成57 kDa的形式[17]，從線粒體內膜上代償性釋放并轉移至細胞核內，選擇性地破壞大分子量的DNA核酸分子，導致細胞死亡。

AIF主要在腦組織的神經元細胞中表達。AIF評分的高低，取決于AIF免疫組化染色強度及AIF陽性細胞數占總的神經細胞數的百分比。本結果顯示，與對照組比較，AD組海馬的CA1、DG以及TC的Ⅰ-Ⅲ區，AIF評分顯著升高(P<0.05)，在海馬CA2、CA3、EC和TC Ⅳ-Ⅵ區的表達無明顯變化(P>0.05)；這與文獻報道[18]。 AIF參與了整個AD的病理過程,它的高表達具有雙重作用，一方面可代償性的對抗AD的病理性變化，比如對抗氧化應激和清除呼吸機產生的相關自由基；另一方面，AIF又可引起AD的氧化應激，AIF能促進凋亡的發生[18-21]。AD組在海馬CA1、CA2、CA3、DG、EC和TC區的AIF細胞核轉移百分比升高(P<0.05)，說明在AD組和對照組各部位分區均出現了差異性，這也進一步證實了在AD的大腦神經細胞中發生了AIF核轉移，AIF的核轉移和AD的病理改變具有相關性，AIF從線粒體到細胞核的異位表達，導致神經細胞死亡，AIF是AD大腦中神經細胞丟失的重要病理因子之一[18]。

注：鏡下100倍，標尺為50 μm圖1　AIF蛋白在人腦海馬、EC及TC區的表達(100×)Fig.1　AIF score in hippocampus, entorhinal and temporal cortices

注：箭頭所示為鏡下所見AIF核染色陽性細胞圖2　兩組被檢者海馬各區、EC及TC的AIF核轉移(200×)Fig.2　Nuclear AIF-ir in the CA1, entorhinal and temporal cortices

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(2016-01-31收稿，2016-06-30修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

Expression and Significance of Apoptosis Inducing Factor in the Brain of Alzheimer's Disease

YANG Mei, REN Zhenkui, YU Wenfeng, GUAN Zhizhong

(KeyLabofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou，China)

國家自然科學基金(81360199); 教育部科學技術研究項目(213032A); 貴州省國際科技合作項目[黔科合外G字(2013)7026號]

Email:wenfengyu2013@126.com

R34-33

A

1000-2707(2016)08-0869-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.001

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網絡出版時間：2016-08-23網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160823.1343.032.html