苗藥組方熏蒸療法治療家兔早期膝骨性關節炎*

王興桂， 張力文， 王　政， 王貴春， 陳盼碧， 周漢華， 崔　瑾**

(1.貴陽中醫學院, 貴州 貴陽　550025； 2.凱里市中醫醫院， 貴州 凱里　556000)

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苗藥組方熏蒸療法治療家兔早期膝骨性關節炎*

王興桂1， 張力文1， 王政2， 王貴春2， 陳盼碧1， 周漢華1， 崔瑾1**

(1.貴陽中醫學院, 貴州 貴陽550025； 2.凱里市中醫醫院， 貴州 凱里556000)

目的： 觀察苗藥熏蒸療法對家兔早期膝骨性關節炎(KOA)的治療效果。方法： 40只新西蘭家兔隨機分為A組(正常對照組)、B組(模型對照組)、C組(苗藥熏蒸組)及D組(蒸餾水熏蒸組)，B、C、D組均采用木瓜蛋白酶注射法制造家兔早期KOA模型，A、B兩組不予任何治療，C、D兩組在造模同時分別采用苗藥組方和蒸餾水進行熏蒸治療；實驗結束時取各組家兔膝關節前正中矢狀位股骨內髁內側軟骨標本制片，光鏡掃描、電鏡觀察，采用Mankin’s法進行評分。結果： C組肉眼、光鏡及電鏡下軟骨組織退變病理學改變較B、D組輕，但較A組重； Mankin’s評分顯示，C組較B、D組低，較A組高(P<0.01)。結論： 苗藥熏蒸療法可以延緩KOA關節軟骨的退變，對早期KOA具有較好的治療作用。

苗藥熏蒸療法； 膝骨性關節炎； 家兔； 光鏡； 電鏡； 模型，動物

祖國傳統醫學認為膝骨性關節炎(knee osteoarthritis, KOA)屬于“痹癥”范圍，其根本原因是因為風寒濕邪侵襲人體，導致血脈痹阻不通，氣血運行受阻，或者是肝腎虧虛，經血不足，不能濡養筋骨而發病，病程相對較長，纏綿不愈。苗藥熏蒸療法治療KOA具有緩解疼痛、協調關節運 動功能及延緩KOA發展等作用，苗藥熏蒸療法是我國少數民族地區普遍使用的外治療法，它的治療途徑是經皮直接作用，藥氣從皮膚及黏膜滲入，可以避免藥物經過胃腸道吸收的首過效應，從而降低了藥物對人體的損害。苗藥熏蒸利用毒性藥物外治疾病是苗醫藥中獨特的“以毒攻毒”方法。本研究通過在兔膝關節腔內注射木瓜蛋白酶復制早期KOA模型，選取長期實驗及臨床驗證有效的苗藥驗方進行熏蒸治療，觀察苗藥熏蒸對早期KOA的療效，為苗醫藥治療KOA提供理論及實驗室依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器

3月齡新西蘭兔40只，雌雄各半，體質量(0.50±0.10)kg，由重慶醫科大學提供。飼養溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，光照節律6∶00～18∶00，雌雄隔離，飼常規顆粒飼料，自由飲水，動物房保持安靜。木瓜蛋白酶(SIGMA公司產品)、4%多聚甲醛、10%水合氯醛。經貴陽中醫學院藥學院周漢華教授鑒定的貴州苗族熏蒸用藥處方：透骨香30 g、艾納香30 g、白龍須6 g、大血藤10 g、五香血藤10 g、土一枝蒿10 g、艾葉15 g等[1]。電子天平AR153O型(美國ohaus公司)、仿制汪元等[2]的動物熏蒸裝置。

1.2方法

1.2.1分組、造模及治療將40只新西蘭兔隨機分為A組(正常對照組)、B組(模型對照組)、C組(苗藥熏蒸組)、D組(清水對照組)，每組10只。參照文獻[2-3]的方法制造家兔KOA模型。在正常條件下喂養1個星期后，B、C、D組兔的右膝關節腔內注入1.6%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.5 mL，3 d后再注射第2次，一共2次。造模結束后，隨機抽取2只家兔鑒定造模是否成功，主要通過肉眼觀察、HE染色和改良Mankin’s評分[3-4]進行鑒定。C組在開始復制KOA模型的同時用8%～70%苗藥液熏蒸治療，將家兔放入到動物熏蒸裝置中熏蒸右膝關節，于39～40 ℃，每次治療10 min，連續治療20 d；D組在相同條件下給予蒸餾水熏蒸患部，A組和B組不做熏蒸處理。

1.2.2檢測指標于實驗結束時處死家兔，取膝關節前正中矢狀位股骨內髁內側軟骨，切片厚3 mm，4%多聚甲醛中固定。將置于多聚甲醛中的軟骨組織染色。光學顯微鏡下按Mankin’s骨關節病病理組織分類方法進行評分；將取得的膝關節前正中矢狀位股骨內髁內側軟骨標本；制成2 mm×1 mm切片，投入4 ℃的3%戊二醛酸溶液中固定，掃描電鏡下觀察、攝片。

1.3統計學處理方法

2　結果

2.1關節軟骨外在形態觀察

A組關節軟骨為淺藍白色，半透明狀，表面很光滑，無裂紋及軟化，無骨贅生成和滑膜增生，具有一定彈性，關節液比較清晰；B組關節軟骨為灰黃色，色澤灰暗，表面粗糙，部分地方可有軟骨下骨裸露，邊緣有很多骨贅生成；關節液及滑液量較多且渾濁，關節囊及滑膜可見程度不等的增生、水腫；C組關節軟骨呈淡白色，色澤暗淡，粗糙感不明顯，軟骨缺損不明顯，還具有一定的彈性和透明狀；關節液清晰，滑膜無增生；D組關節軟骨呈淡黃色，表面粗糙，無光澤，透明程度和彈性均下降，邊緣有骨贅生成；見圖1。

2.2關節軟骨光鏡觀察

A組見軟骨表面光滑、整齊；厚度正常、結構、潮線清晰；軟骨細胞正常，軟骨陷窩分布正常，軟骨基質染色正常，阿爾新藍染色呈深藍色；B組見軟骨表面粗糙、凹陷；厚度相對正常，4層結構層次不清，表層纖維化，幅射層和深層軟骨基質纖維松散，且可見脂肪沉積；表層軟骨細胞數目較少，深層見軟骨細胞增多且排列紊亂，無軟骨陷窩及潮線；軟骨基質染色少，阿爾新藍染色見淺藍色；C組見軟骨表面稍粗糙；軟骨厚度接近正常，4層結構層次清楚，軟骨表層稍纖維化，幅射層和深層軟骨基質纖維正常；軟骨細胞數量正常，但排列稍紊亂，軟骨陷窩正常；潮線清，結構完整；軟骨基質染色稍少，阿爾新藍染色呈藍色；D組見，軟骨表面粗、凹陷；軟骨厚度變薄，4層結構層次稍紊亂，軟骨表層纖維化，幅射層和深層軟骨基質纖維松散；軟骨基質染色輕度減少，阿爾新藍染色呈淡藍色；見圖2。

空白對照組　　　　　　　　模型對照組　　　　　　　　苗藥熏蒸組　　　　　　　　蒸餾水熏蒸組圖1　4組家兔膝關節軟骨標本Fig.1　Gross observation of rabbit knee cartilage in 4 groups

空白對照組　　　　　　　　模型對照組　　　　　　　　苗藥熏蒸組　　　　　　　　蒸餾水熏蒸組圖2　4組家兔膝關節軟骨組織切片HE染色(400×)Fig.2　 The performance of rabbit knee cartilage under light microscope in 4 groups

空白對照組　　　　　　　　模型對照組　　　　　　　　苗藥熏蒸組　　　　　　　　蒸餾水熏蒸組圖3　4組家兔軟骨組織切片阿爾新藍染色(400×)Fig.3　The performance of rabbit knee cartilage under light microscope in 4 groups

2.3關節軟骨電鏡觀察

A組軟骨表面光滑平整，其膠原蛋白纖維呈條索狀、相互交織成網。網狀膠原纖維蛋白間有小間隙，呈多孔狀，間隙均勻；B組軟骨表面凹凸不平，其膠原網架結構紊亂，被大量條絮狀物覆蓋；較多的膠原纖維囊樣變，多孔狀結構模糊，間隙排列較亂；膠原蛋白纖維變粗、序列亂，形成蟲蝕樣變化；C組軟骨的表面較平，膠原蛋白纖維呈條索狀、相互交織成網，像正常軟骨表面；但其表面條絮狀物覆蓋，其間的多孔狀結構欠清；D組軟骨表面欠平整，膠原網架結構亂，有大量條絮狀物覆蓋；膠原纖維出現囊樣變，圓形突起增多；纖維之間的多孔狀結構模糊，空隙排列紊亂，有的膠原蛋白纖維甚至呈蟲蝕樣改變；見圖4。

空白對照組　　　　　　　　模型對照組　　　　　　　　苗藥熏蒸組　　　　　　　　蒸餾水熏蒸組圖4　4組家兔膝關節軟骨電鏡下表現(1 000×)Fig.4　The performance of rabbit knee cartilage under light microscope in 4 groups

2.4組織學Mankin’s評分

Mankin’s骨關節病病理組織分類評分結果顯示，與A組比較，B、C、D組Mankin’s評分顯著升高(P<0.01)；與B組比較，C組、D組評分降低(P<0.01)；與D組比較，C組評分降低(P<0.01)。

表1　各組家兔膝關節病理學Mankin’s評分

(1)與A照組比較，P<0.01；(2)與B組比較，P<0.01；(3)與C組比較，P<0.01

3　討論

膝關節是人體最大的負重關節，外傷、過度活動等因素都可以引起KOA的發生，其病理特點為關節軟骨的變性破壞、軟骨下骨硬化或囊性病變、關節邊緣骨質增生、滑膜增生、關節囊攣縮、韌帶松弛或攣縮、肌肉萎縮無力等[5]。其負荷傳遞的紊亂導致關節軟骨損傷、退變，從而使軟骨細胞的代謝紊亂，因此發展為KOA[6]。KOA以膝關節退行性變為主要的病理改變，多見于老年人，是老年人腿痛的主要原因，肥胖、走路姿勢的異常、長時間的受涼等也是導致KOA發生的重要因素，相關因素導致膝關節生物力學失衡就可以引起關節的應力變化，引起負荷傳遞的紊亂導致關節軟骨損傷、退變，從而使軟骨細胞的代謝紊亂，最終發展為KOA[7]。膝關節的韌帶和軟組織是保持其穩定性的重要結構，當關節軟骨進一步損壞、骨贅形成時，關節周圍的韌帶、肌腱等軟組織會產生粘連等退行性病變，從而導致膝關節自由活動受限，致使膝關節更加不穩，力學結構進一步發生改變，從而加重KOA病情[8-9]。苗醫藥熏蒸療法作為祖國傳統醫學中的一種外治療法，主要有藥療與熱療兩方面的作用，可使藥物直接到達病處，加強局部血液循環，達到防治疾病的目的。因其不經過胃腸道吸收可以有效的避免藥物對胃腸道刺激而產生的副作用，而且直接作用于病變部位，尤其對痹癥等風濕痹痛、皮膚疾病等病變有很好的療效，因此被醫學界譽為“綠色療法”。

無論是原發性還是繼發性的KOA，其關節損傷的病理都是由于內、外因素的作用引起軟骨受損，軟骨基質的分解和合成代謝失調造成軟骨的破壞[8]，軟骨發生代償性增生，引起骨贅的形成。本次實驗結果顯示，與B組比較，C組軟骨組織在肉眼、光鏡、電鏡下病理改變明顯減輕，Mankin’s評分明顯降低，其效果相比D組較明顯，說明苗藥熏蒸療法可以延緩軟骨的退變，對早期KOA具有較好的治療作用。

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(2016-04-29收稿，2016-08-08修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

The Efficacy of Miao Medicine Fumigation Therapy in the Treatment of Rabbit with Early Knee Osteoarthritis

WANG Xinggui1, ZHANG Liwen1, WANG Zheng2, WANG Guichun2, CHEN Panbi1, ZHOU Hanhua1, CUI Jin1

(1.GuiyangMedicalcollegeofTCM,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.KailiCityTCMHospital,Kaili556000,Guizhou,China)

Objective: To observe the efficacy of the Miao medicine fumigation therapy in the treatment of rabbit with early knee osteoarthritis (KOA). Method: 40 New Zealand rabbits were enrolled in this study, and randomly divided into group A(control group), group B(model control group), group C(Miao medicine fumigation group) and group D(water control group). The papain injections method was adopted to establish early KOA rabbit model in group B, group C and group D. Group A and group B received no treatment while group C and group D received Miao medicine fumigation and water fumigation, respectively. After treatment, the medial condylar cartilage samples were taken from the anterior median sagittal femoral medial condyle of the rabbits in each group, and light microscope, scanning electron microscope were used for observation and Mankin 's rating method was used to evaluate. Results: Compared with group B and group D, the cartilage tissue degeneration pathological changes in group C was less severe, but more severe compared with group A. Mankin's rating method showed that Mankin's score in group C was lower than that of group B and group D while higher than that of group A. Conclusion: Miao medicine fumigation therapy can delay the degeneration of articular cartilage of KOA, and has a better therapeutic effect on early KOA.

Miao medicine fumigation therapy; knee osteoarthritis; rabbit; light microscope; electron microscope; model,animal

國家自然基金項目(81260575)； 國家苗藥工程技術研究中心項目(2014FU125Q09)

E-mail:516260179@qq.com

R29

A

1000-2707(2016)09-1025-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.008

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網絡出版時間：2016-09-12網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.r.20160912.0924.002.html