云南漢族人群CD80基因多態性位點與肺癌的相關性*

李傳印， 李盈甫， 史　荔， 馬千里， 王云飛， 蔡秋龍， 洪　超， 俞建昆， 張新文， 姚宇峰

(1.中國醫學科學院&北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室， 云南 昆明　650118； 2.昆明醫科大學第一附屬醫院 干療科， 云南 昆明　650032； 3.昆明醫科大學第三附屬醫院 胸外科， 云南 昆明　650118)

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云南漢族人群CD80基因多態性位點與肺癌的相關性*

李傳印1， 李盈甫2， 史荔1， 馬千里3， 王云飛1， 蔡秋龍1， 洪超1， 俞建昆1， 張新文1， 姚宇峰**

(1.中國醫學科學院&北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室， 云南 昆明650118； 2.昆明醫科大學第一附屬醫院 干療科， 云南 昆明650032； 3.昆明醫科大學第三附屬醫院 胸外科， 云南 昆明650118)

目的： 探討云南漢族人群中CD80基因中的多態性位點(SNPs)rs16829980(A>G)、rs16829984(G>C)、rs41271391(G>T)及rs41271393(C>T)與肺癌的相關性。方法： 選取云南地區漢族人群肺癌患者288例(病例組)，健康體檢人群288例(對照組)，采用TaqMan探針基因分型方法對CD80基因中上述4個SNPs位點進行基因分型，研究其等位基因、基因型及所構建的單倍型在兩組人群中的分布差異。結果： rs16829980(A>G)等位基因A和G、rs41271391(G>T)等位基因G和T、rs41271393(C>T)等位基因C和T在病例組和對照組中的分布頻率的差異具有統計學意義(P=0.018, 0.015, 0.015)，單倍型分析結果顯示GGTT單倍型是云南漢族人群肺癌發生的保護性因素(OR=0.723; 95%CI: 0.555～0.941)。結論： CD80基因SNPs位點rs16829980(A>G)中等位基因A、rs41271391(G>T)中等位基因G以及rs41271393(C>T)的等位基因C可能是云南漢族人群肺癌發生的危險因素，GGTT單倍型可能是云南漢族人群肺癌發生的保護性因素。

肺腫瘤； CD80基因； 單核苷酸多態性； 相關性； 漢族； 云南

肺癌是威脅人類健康的發病率最高的癌癥，全世界每年約有160萬死亡病例(占所有腫瘤死亡人數的19.4%)，而在中國肺癌新發病例和死亡人數約為70萬和60萬[1]。研究表明吸煙人群中患肺癌的風險是不吸煙者的20倍，這說明吸煙是肺癌發生的重要危險因素之一，但并非唯一誘因[2]。近年來研究發現宿主遺傳因素在肺癌發生過程中也發揮重要作用，尤其是參與免疫識別和抗原提呈等基因中存在的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)在肺癌發生發展過程中有顯著影響[3-5]。CD80(又被稱作B7-1)屬于免疫球蛋白超家族成員，表達于抗原提呈細胞(APC)表面，為T細胞的活化提供重要的共刺激信號。腫瘤細胞表面CD80通常表達缺失，這對于腫瘤細胞的免疫逃逸機制非常重要。個體間CD80表達與否以及表達水平差異可能會造成個體免疫應答效率的差異，這可能在疾病甚至腫瘤發生中發揮重要作用。基因中的SNPs可能會影響基因表達及功能，研究顯示CD80基因中的SNPs與多種疾病或癌癥相關[6-7]。本研究選取4個位于CD80基因啟動子及5′-UTR區域的SNPs位點：rs16829980(A>G)、rs41271391(G>T)、rs41271393(C>T)和rs16829984(G>C)，研究這些SNPs位點在云南漢族人群肺癌患者和健康人群中的分布，以期為肺癌的診斷、治療提供新的靶點及思路。

1　對象與方法

1.1對象

根據“知情同意”原則，隨機選取2012年10月～2014年5月確診為肺癌的患者288例為病例組，采用世界衛生組織(WHO 2004)肺癌組織類型劃分標準進行病理分型，采用國際肺癌臨床分期系統進行臨床分期。排除標準：(1)術前接受放化療等抗腫瘤治療的病例，(2)患有其他惡性腫瘤，或合并心血管疾病、糖尿病、肝炎、腎病等疾病的患者，(3)資料不全者。對照組288人為2013年10月～2016年5月正常體檢者。所有對象均為居住于云南地區彼此無血緣關系的漢族個體，年齡30～75歲。病例組平均(55.55±10.67)歲，男女性別比197/91，病理類型鱗癌101例，腺癌178例，鱗腺癌5例，其他4例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期92例，196例。對照組平均(54.01±10.12)歲，男女性別比192/96，兩組被檢者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2基因組DNA提取和基因分型檢測

采集空腹靜脈血5 mL，用EDTA 或肝素抗凝，使用全血基因組DNA 提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，購于QIAGEN公司，貨號51106)提取DNA。并用超微量紫外可見分光光度計(ND-2000，美國ThermoScientific公司)檢測DNA的濃度和純度。采用TaqMan探針熒光定量PCR方法檢測SNPs位點的基因分型，TaqMan探針、引物和SNPs分型試劑(TaqMan Genotyping Master Mix)均購自美國ABI公司(http://www.appliedbiosystems.com)。羅氏LightCycler 480 實時熒光定量PCR 儀檢測SNPs 位點，并對檢測樣本SNPs位點進行分型。PCR 反應體積為20 μL，反應條件為95 ℃預變性10 min，92 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min，共40 個循環，40 ℃ 5 min 長延伸。分型試驗以水代替樣本模板作為陰性對照。用羅氏LightCycler 480 基因分型軟件(LCS480 1.5.1.62)進行結果分析和基因分型，分型完成后對部分TaqMan分型結果進行測序驗證。

1.3統計學分析

使用Hardy-Weinberg平衡檢驗樣品的代表性，t檢驗檢測對照組和病例組年齡是否有差異，χ2檢驗檢測病例組和對照組性別是否有差異，并檢測病例組和對照組中CD80基因各SNPs 位點基因型和等位基因頻率的差異。SHEsis軟件程序[8]計算連鎖不平衡，用D′表示，D′值為0時，連鎖完全平衡；D′值為1 時，連鎖完全不平衡；D′>0.8時，認為存在強連鎖。根據連鎖不平衡結果構建單倍型，并檢測單倍型頻率在病例組與對照組之間的差異[9]。多重比較時采用Bonferroni進行校正，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1樣品的代表性

CD80基因啟動子區個SNPs 位點rs16829980(A>G)、rs16829984(G>C)、rs41271391(G>T)和rs41271393(C>T)的基因型在對照組和病例組中的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，說明本研究中的樣本是具有群體代表性的隨機樣本。

2.24個CD80 SNPs位點與云南漢族人群肺癌的相關性

結果顯示，與對照組比較，病例組rs16829980(A>G)等位基因A的分布頻率升高，G的分布頻率降低，差異有統計學意義(P=0.018)，等位基因A是云南漢族人群肺癌發生的危險因素(OR=1.373， 95%CI：1.056～1.784)；rs41271391(G>T)中等位基因G的分布頻率升高，T的分布頻率降低，差異有統計學意義(P=0.015)，該位點等位基因G是云南漢族人群是肺癌發生的危險因素(OR=1.38,95%CI：1.065～1.796)；rs41271393(C>T)的等位基因C的分布頻率升高，T的分布頻率降低，差異有統計學意義(P=0.015)，該位點等位基因C是云南漢族人群肺癌發生的危險因素(OR=1.385; 95%CI：1.065～1.801)。而rs16829984(G>C)等位基因和基因型在對照組和病例組中的分布頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　4個CD80 SNPs位點基因型和等位基因在病例組和對照組的分布

2.34個CD80 SNPs位點連鎖不平衡

連鎖不平衡分析結果顯示，在病例組和對照組rs16829980(A>G)、rs16829984(G>C)、rs41271391(G>T)和rs41271393(C>T)間存在連鎖不平衡，且各位點間D′值均>0.8，各位點間存在強連鎖。

2.44個CD80 SNPs位點單倍型的構建

根據連鎖不平衡結果構建rs16829980(A>G)、rs16829984(G>C)、rs41271391(G>T)和rs41271393(C>T)的單倍型，并對頻率>3%的單倍型的分布頻率進行分析，結果顯示經過P值校正后， GGTT單倍型在病例組和對照組的分布頻率的差異具有統計學意義(P<0.05)，說明該單倍型是云南漢族人群肺癌發生的保護性因素(OR=0.723; 95%CI:0.555～0.941)，見表2。2.54個CD80 SNPs位點與肺癌臨床分期的關系

對CD80基因中4個SNPs位點在肺癌Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期中的分布頻率進行分析，結果顯示CD80基因中的4個SNPs位點的基因型和等位基因在肺癌Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期中的分布頻率分別比較，結果顯示各分布頻率間的差異無統計學意義(P>0.05)，說明CD80基因的4個SNPs位點的基因型和等位基因型分布與云南漢族人群肺癌的嚴重程度無關，見表3。

表2　4個CD80 SNPs位點的單倍型在病例組和對照組中的分布

表3　CD80 4個SNPs位點基因型和等位基因在不同臨床分期肺癌中的分布

2.64個CD80 SNPs與肺癌病理類型的關系

結果顯示CD80基因中的4個SNPs位點的基因型和等位基因在鱗癌和腺癌患者中的分布頻率差異無統計學意義(P>0.05)，表明CD80基因中4個SNPs位點可能與云南漢族人群肺癌的病理類型無關。見表4。

表4　4個CD80 SNPs位點基因型和等位基因在肺鱗癌和肺腺癌患者中的分布

3　討論

腫瘤的發生發展與機體免疫系統緊密相關，腫瘤細胞表達腫瘤特異性的抗原，可被機體免疫系統識別并清除，因此腫瘤的發生發展過程需要腫瘤細胞免疫逃避或誘導免疫抑制[11-13]。T細胞免疫是機體對抗腫瘤免疫的重要組成部分，T細胞的活化不僅需要MHC分子將特異性抗原提呈給T細胞表面的受體(TCR)，還需要第二信號，即抗原提呈細胞表面的共刺激分子與其配體結合產生的共刺激信號[13-15]。 CD80與其配體產生的共刺激信號是T細胞活化最重要的共刺激信號之一，研究發現，大多數腫瘤細胞表面缺乏CD80等共刺激分子，而這使抗腫瘤免疫中的平衡偏向了腫瘤細胞的免疫逃逸[16]。而向腫瘤細胞轉染CD80可以在一定程度上挽回這種平衡，抑制腫瘤的生長，這說明共刺激分子在抗腫瘤免疫應答中發揮重要的作用[17-18]。目前大量研究結果表明CD80基因中的某些SNPs與疾病存在相關性[6-7,19]。CD80分子在許多腫瘤細胞表面缺少表達，這可能是腫瘤的一種免疫逃逸機制。而位于CD80基因啟動子區域的SNPs可能是導致CD80在腫瘤細胞表面缺少表達的因素。因此本研究選取位于CD80啟動子及5′-UTR區域的4個SNPs位點，研究其在云南漢族人群肺癌患者與健康對照人群中的分布差異，以確定這些SNPs位點與云南漢族人群肺癌發生與發展的相關性。

本研究結果顯示rs16829980(A>G)中等位基因A、rs41271391(G>T)中等位基因G以及rs41271393(C>T)的等位基因C可能是云南漢族人群肺癌發生的危險因素，這可能是由于這些等位基因不利于CD80基因的表達，從而能促進疾病發生，而rs16829984(G>C)等位基因可能對CD80表達沒有顯著影響，所以在疾病發生過程中也不發揮顯著作用，但目前這些SNPs位點是否影響CD80基因的表達水平以及相關機理還不是很清楚，這也將是下一步的研究重點。Wagner等[21]及Teutsch等[7]發現rs16829980(A>G)與多發性硬化疾病和人群無關，而本研究中該位點等位基因在肺癌病例和健康對照中的分布頻率的差異有統計學意義(P<0.05)，rs16829980(A>G)是云南漢族人群肺癌發生的危險因素，說明這種相關性具有疾病和人種的特異性。本研究還發現rs41271391(G>T)以及rs41271393(C>T)等位基因與云南漢族人群肺癌的發生具有相關性， 4個SNPs存在較強的連鎖關系，選擇樣本分布頻率>3%的單倍型進行分析， 結果顯示GGTT單倍型在病例組和對照組中分布頻率的差異有統計學意義(P<0.05)，該單倍型是云南漢族人群肺癌發生的保護性因素(OR=0.723，95%CI：0.555-0.941)。這與本研究中rs16829980(A>G)中等位基因A、rs41271391(G>T)中等位基因G以及rs41271393(C>T)的等位基因C可能是云南漢族人群肺癌發生的危險因素的結果相符。另外，本研究還分析了這4個位于CD80基因中的SNPs與云南漢族人群肺癌不同臨床分期以及不同病理類型的關系，結果顯示這些SNPs與云南漢族人群肺癌不同臨床分期以及病理類型無關。

綜上所述，本研究發現CD80基因啟動子及5′-UTR區SNPs位點rs16829980(A>G)中等位基因A、rs41271391(G>T)中等位基因G以及rs41271393(C>T)的等位基因C是云南漢族人群肺癌發生的危險因素，GGTT單倍型是云南漢族人群肺癌發生的保護性因素，而本研究選取的SNPs位點位于CD80基因的啟動子及5′-UTR區域，因此推測rs16829980(A>G)中等位基因A、rs41271391(G>T)中等位基因G以及rs41271393(C>T)的等位基因C以及單倍型GGTT有可能是通過影響CD80基因轉錄及翻譯效率，從而影響CD80基因的轉錄與表達水平，進一步影響抗原提呈過程中共刺激信號的產生，最終造成個體對疾病易感性的差異。然而要最終闡明這些SNPs位點與肺癌相關性的機理，還需對其進行功能研究。

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(2016-05-15收稿，2016-08-18修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

The Association of SNPs in CD80 Gene with Lung Cancer in Yunnan Han Population

LI Chuanyin1, LI Yingfu2, SHI Li1, MA Qianli3, WANG Yunfei1, CAI Qiulong1, HONG Chao1, YU Jiankun1, ZHANG Xinwen1, YAO Yufeng1

(1.InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,YunnanKeyLaboratoryofVaccineResearch&DevelopmentonSevereInfectiousDisease,Kunming650118,Yunnan,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,Yunnan,China; 3.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,Yunnan,China)

Objective: To explore the association of four single nucleotide polymorphisms (SNPs) rs16829980A>G, rs16829984G>C, rs41271391G>T and rs41271393C>T in CD80 gene with the lung cancer in a Yunnan Han population. Methods: A total 288 patients with lung cancer and 288 healthy individuals were recruited in this study, and the genotyping of the above-mentioned four SNPs was analyzed by Taqman assay. The distribution of alleles, genotypes and constructed haplotypes in the two groups was studied. Results: There were statistically significant differences in distribution of A and G of rs16829980 A>G, G and T of rs41271391G>T, C and T of rs41271393 C>T between the case group and control group (P=0.018, 0.015 and 0.015). The frequencies of haplotypes result showed that GGTT haplotypes was protective factors of lung cancer in Han population of Yunnan Province (OR=0.723; 95%CI: 0.555～0.941). Conclusion: The A allele of rs16829980 A>G (OR=1.373; 95%CI: 1.056～1.784), the G allele of rs41271391G>T (OR=1.382; 95%CI: 1.065～1.796) and the C allele of rs41271393C>T (OR=1.385; 95%CI: 1.065～1.801) may be risk factors of lung cancer.

lung cancer; CD80 gene; single nucleotide polymorphisms; association; Han population; Yunnan province

國家自然基金項目(31270030、81573206)； 協和青年基金(3332015149)； 云南省應用基礎研究重點項目(2016FA034)； 云南省科技廳-昆明醫科大學應用基礎研究聯合專項(2013FB169)； 中國醫學科學院病原生物學研究所基本科研業務費項目(2012IPB107)

E-mail:leoyyf@gmail.com

R734.2； RZ274

A

1000-2707(2016)09-1015-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.006

**

網絡出版時間：2016-09-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.030.html