頭花蓼對幽門螺桿菌胃炎大鼠血清干擾素-γ和白細胞介素-4含量的影響*

馮海潮， 孫朝琴， 張　姝， 何　蕓， 吳　瓊， 莫　非， 羅昭遜*

(貴州醫科大學， 貴州 貴陽　550004)

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頭花蓼對幽門螺桿菌胃炎大鼠血清干擾素-γ和白細胞介素-4含量的影響*

馮海潮**， 孫朝琴， 張姝， 何蕓， 吳瓊， 莫非， 羅昭遜***

(貴州醫科大學， 貴州 貴陽550004)

目的： 探討苗藥頭花蓼對幽門螺桿菌(H.pylori)感染相關性胃炎大鼠血清干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)含量的影響。方法： 30只SD大鼠隨機分為空白組、模型組及頭花蓼組,采用H.pylori灌胃造模，空白組灌胃無菌腦心浸液肉湯，模型組和頭花蓼組用消炎痛預處理后灌胃H.pylori制作H.pylori感染相關性胃炎大鼠模型，之后空白組和模型組大鼠灌胃生理鹽水、頭花蓼組大鼠灌胃頭花蓼2周；采用HE染色評估胃黏膜炎炎癥損傷程度，酶聯免疫(ELISA)法檢測3組大鼠血清IFN-γ、IL-4含量，實時熒光定量PCR(real time-PCR)檢測胃黏膜中IFN-γ、IL-4 mRNA的相對表達水平。結果：H.pylori灌胃造模后，大鼠胃竇黏膜有H.pylori定植，HE染色結果顯示模型組大鼠胃組織呈現相關性胃炎病理形態改變；頭花蓼干預后，H.pylori感染大鼠胃黏膜炎癥明顯改善，IFN-γ mRNA表達水平明顯下調、IFN-γ血清含量明顯降低，與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；而頭花蓼干預對IL-4分泌的影響比較輕。結論： 頭花蓼可減輕H.pylori對胃黏膜炎性損傷，其機制可能是通過下調IFN-γ mRNA轉錄水平而實現的。

頭花蓼； 苗藥； 幽門螺桿菌； 干擾素-γ； 白介素-4； 炎癥； 大鼠，Sprague-Dawley

頭花蓼是貴州省的精選苗藥，具有清熱利濕，活血解毒的功效，對幽門螺桿菌具有抗菌活性[1-3]。課題組前期研究發現頭花蓼體外可刺激淋巴細胞增殖，促進干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)和白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)的分泌，參與機體免疫調節[4]。INF-γ、IL-4分別作為T淋巴細胞的兩種亞型Th1型和Th2型的代表因子，其分泌水平可一定程度上反映機體的免疫狀態。本研究采用酶聯免疫(ELISA)和實時熒光定量PCR(real time-PCR)方法檢測頭花蓼治療前后H.pylori胃炎大鼠血清IFN-γ、IL-4的含量及胃黏膜IFN-γ、IL-4 mRNA相對表達水平，旨在探討頭花蓼改善H.pylori感染相關性胃炎的免疫調節作用機制。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

頭花蓼浸膏粉(批號141196)，由浙江眾益有限有限責任公司提供。H.pylori馴化株SS200由中國疾病控制中心傳染病所張建中教授惠贈，保存于貴州醫科大學醫學檢驗學院臨床檢驗教研室。SPF級SD大鼠30只，周齡6～8周，體質量150～180 g，購自第三軍醫大學實驗動物中心，合格證號SYXK(渝)2012-0001，實驗獲得貴州醫科大學倫理委員會批準。試劑有哥倫比亞血瓊脂粉(購自Oxoid)，腦心浸液瓊脂(購自Oxoid)，無菌脫纖維羊血(購自南京便診生物科技有限公司)，ELISA試劑盒(購自ebioscience)，RNA提取試劑盒(購自Omega)，RNA逆轉錄試劑盒(購自Takara)，real time-PCR試劑盒(購自Takara)。主要儀器有酶標儀(BIO-xMark生產)，三氣培養箱(Thermo生產)，熒光定量PCR儀(購自德國ROCHE)。

1.2方法

1.2.1H.pylori培養和菌液制備H.pylori培養：H.pylori復蘇后穩定傳代3次，取長勢良好菌苔接種于哥倫比亞血瓊脂平板，置微需氧環境(85%N2，10%CO2，5%O2)培養48 h。菌懸液制備：無菌接種環從哥倫比亞血瓊脂平板上收集H.pylori菌落，以預冷的無菌腦心浸液肉湯制成混懸液，3 000 g，4 ℃離心3 min后，棄上清液，洗滌3次，采用比濁法調整菌懸液濃度為1×1012cfu/L，預冷，備用。

1.2.2H.pylori感染相關性胃炎大鼠模型30只SPF級SD大鼠隨機分為空白組、模型組和頭花蓼組，每組10只；參照文獻[5-6]，大鼠適應性飼養1周后，禁食禁水12 h，模型組和頭花蓼組采用1.0 mL/只的消炎痛藥液(1g/L)預處理6 h后用H.pylori懸液1.5 mL/只隔天灌胃，連續5次；空白組以等量的無菌腦心浸液肉湯代替。灌胃8周后，每組隨機取3只大鼠處死，留取胃竇黏膜組織用于H.pylori相關性胃炎模型鑒定。

1.2.3H.pylori相關性胃炎模型鑒定H.pylori感染的鑒定：采用快速尿素酶實驗、組織切片Giemsa染色以及細菌培養檢測H.pylori，3項實驗中至少2項陽性判斷為H.pylori感染。H.pylori相關性胃炎評價：取胃竇黏膜組織用4%中性甲醛固定，常規HE染色，病理醫生雙盲閱片，行胃黏膜慢性炎癥評分。SD大鼠胃黏膜有H.pylori定植且出現慢性炎癥病理學改變，判斷為造模成功。

1.2.4頭花蓼干預治療成功建模后，頭花蓼組參照文獻[7-8]的頭花蓼臨床[3.49 g生藥/(kg·d)]3倍劑量作為治療H.pylori感染SD大鼠的給藥劑量進行灌胃處理，連續14 d(1次/d)，空白組和模型組給予等量的無菌生理鹽水。治療結束后4周處死所有大鼠，留取大鼠胃竇黏膜組織和靜脈血，用于后續研究。

1.2.5血清FN-γ和IL-4含量取各組大鼠血清200 μL，采用ELISA法檢測血清IFN-γ和IL-4含量，具體操作按ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.6胃黏膜組織IFN-γ、IL-4 mRNA表達采用real time-PCR法，用Omega試劑盒提取胃竇黏膜組織的RNA，逆轉錄為cDNA。采用SYBR ?Ⅱ進行real time-PCR，引物由上海生物工程技術服務公司合成，引物信息見表1。PCR反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，40個循環。采集IFN-γ、IL-4、β-actin內參照基因各循環熒光信號，用EXCEL軟件計算Ct值、ΔΔCt值及相對表達值RQ，ΔCT=CT目的基因-CT內參基因，ΔΔCT=ΔCT給藥組-ΔCT模型組，IFN-γ、IL-4的RQ以2-ΔΔCT表示。

表1　PCR引物信息、基因序列號及產物大小

1.3統計學分析

2　結果

2.1H.pylori相關性胃炎模型

H.pylori感染8周后，模型組大鼠胃黏膜快速尿素酶實驗陽性，Giemsa染色見胃竇腺腔內分布有細小、彎曲的短桿菌，微需氧培養見細小、濕潤、透明的針尖樣菌落，菌落經尿素酶、觸酶和氧化酶實驗證實為H.pylori，H.pylori感染率為100%； HE染色結果顯示模型組大鼠胃黏膜破損、糜爛，腺體腫脹，黏膜下層有大量淋巴細胞浸潤，甚至形成淋巴肉芽腫，呈現相關性胃炎病理形態改變(圖1)。說明成功構建H.pylori感染相關性胃炎動物模型。

2.2大鼠胃黏膜組織的HE染色及病理評分

HE染色結果顯示，空白組大鼠胃黏膜完整，腺體規則，黏膜下層偶見淋巴細胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜破損、糜爛，腺體腫脹，黏膜下層有大量淋巴細胞浸潤；經頭花蓼治療后，大鼠胃黏膜損傷得到一定程度的修復，黏膜比較完整，腺體比較規則，黏膜下層散在少量淋巴細胞浸潤，炎癥有所改善；與空白組病理評分比較，模型組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，與模型組比較，頭花蓼組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表2。

注：A 為空白組，B為模型組，C為頭花蓼組；箭頭為胃黏膜腺體腫脹圖1　SD大鼠胃黏膜組織的病理學變化(HE，×400)Fig.1　The pathological change of gastric mucosa of SD rats

組別病理評分(分)空白組0.55±0.37模型組2.59+0.59(1)頭花蓼組1.73±0.40(1)(2)

(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05

2.3血清FN-γ和IL-4含量

H.pylori感染后，模型組大鼠血清IFN-γ含量明顯高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)；經頭花蓼治療后，IFN-γ含量明顯降低(P<0.05)。H.pylori感染后，模型組大鼠血清IL-4含量雖較空白組降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；經頭花蓼治療后，血清IL-4含量雖有所升高，但與模型組比較，差異也無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.4胃黏膜組織IFN-γ和IL-4 mRNA表達

與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜IFN-γ mRNA相對表達量升高，IL-4 mRNA相對表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)，經頭花蓼治療后，與模型組比較，大鼠胃黏膜IFN-γ mRNA的相對表達量下降，差異有統計學意義(P<0.05)； IL-4 mRNA的相對表達量雖有所升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：A為FN-γ，B為IL-4；(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05圖2　大鼠血清FN-γ和IL-4含量Fig.2　Cytokine levels in serum of rats

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05圖3　3組大鼠胃黏膜組織中 IFN-γ、IL-4 mRNA相對表達量比較Fig.3　mRNA levels of IFN-γ and IL-4 of rat gastric mucosa in the three groups

3　討論

H.pylori感染是引起胃炎、胃及十二指腸潰瘍乃至胃癌的獨立危險因素。隨著廣譜抗生素的廣泛應用，使得H.pylori耐藥株不斷增加，研發高效及高選擇性的抗H.pylori藥物已成為趨勢。有研究報道，中藥或中西醫結合用藥可提高H.pylori根除率，改善胃黏膜炎癥或抑制消化性潰瘍，從現代醫學角度分析有功效的中藥抑制H.pylori感染的作用機制[9]。中藥抑制H.pylori相關性胃炎的可能機制為抑制其毒力因子的表達、調節感染所致的免疫失衡、糾正胃腸激素分泌紊亂、干擾信號通路轉導等。本研究采用頭花蓼治療H.pylori感染SD大鼠胃炎模型，對頭花蓼的可能作用機制進行初步分析。輔助性T細胞Ⅰ型和Ⅱ型(Th1、Th2)在人體的免疫中起著重要作用。Th1主要執行因子是IFN-γ和IL-2，而Th2主要執行因子是IL-4、IL-10等，二者通過分泌不同的細胞因子，彼此交叉調節，相互抑制，共同維持Th1/Th2平衡。H.pylori感染后，其抗原持續刺激引起機體局部或整體發生免疫反應。人體和動物實驗均證實H.pylori感染后胃黏膜發生以Th1型為主的免疫反應，Th1型細胞因子分泌增多，而Th2型細胞因子IL-4、IL-10很少或缺乏[10]。但機體在抵御外來抗原與限制自身組織損傷的過程中同時存在Th1、Th2反應與炎癥反應自我平衡的過程，兩種免疫反應相互制約，此起彼伏，其結果決定疾病的結局[11]。

本研究中，H.pylori感染后，大鼠胃黏膜IFN-γ mRNA表達量增高，血清IFN-γ水平上升，而胃黏膜IL-4 mRNA 表達明顯降低，血清IL-4 水平無明顯改變，胃黏膜呈現慢性炎癥損傷。表明H.pylori感染后，發生了Th1偏移，Th2應答受到抑制，Th1應答分泌的大量IFN-γ，增強了局部各種炎癥細胞如巨噬細胞、中性粒細胞的活性，刺激釋放炎癥介質、細胞因子、活性氧簇和活性單簇，引起胃上皮損傷，同時因IFN-γ與IL-4存在相互限制的關系，主要針對胞外感染的Th2應答受到抑制，H.pylori不能有效的被清除，細菌長期持續感染，胃黏膜損傷難以得到修復。另外，有研究報道H.pylori感染早期Th1應答占優勢地位產生過量IFN-γ，增強各類炎癥細胞活性，造成胃黏膜上皮細胞的損傷；而關于H.pylori感染后Th2應答出現較晚，說明Th2應答在H.pylori感染早期發揮作用甚微[12]。本研究中大鼠血清Th2型細胞因子在H.pylori感染后或經治療后，其水平變化輕微，支持以上觀點。經頭花蓼治療后，IFN-γ mRNA表達量降低，血清IFN-γ水平降低，IL-4 mRNA及血清IL-4含量有所升高，提示頭花蓼在促進T細胞向Th2細胞分化方面起重要作用，能抑制IFN-γ水平并下調Th1型免疫反應，從而減輕由H.pylori感染所致的炎癥反應。同時下調Th2應答的因素減弱，有利于炎癥的恢復。

總之，本研究發現頭花蓼可減輕大鼠胃黏膜炎癥反應，其機制與降低IFN-γ等致炎因子水平，抑制H.pylori感染所致Th1/Th2失衡，從而減輕黏膜炎癥有關。然而參與Th1/Th2免疫調節網絡的細胞因子眾多，彼此之間相互聯系，關系錯綜復雜，關于頭花蓼經何種途徑調節Th1/Th2的失衡作用機制仍不明確，還有待進一步研究證實。

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(2016-04-28收稿，2016-08-12修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 趙毅

Effects ofPolygonumcapitatumon Content of IFN-γ and IL-4 in Rats withHelicobacterpyloricGastritis

FENG Haichao, SUN Chaoqin, ZHANG Shu, HE Yun, WU Qiong, MO Fei, LUO Zhaoxun

(GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effects ofPolygonumcapitatumon content of IFN-α and IL-4 in rats withHelicobacterPyloricgastritis. Methods: 30 SD rats were randomly divided into blank group, model group andPolygonumcapitatumgroup. Gastritis was induced in rats by oral gavage withH.pylori; blank group was treated with sterile Brain Heart Infusion Broth, model group andPolygonumcapitatumgroup were first treated with indomethacin, then served to constructH.pyloriinfected relevance gastritis rats model. Blank group and model group were treated with normal saline irrigation,Polygonumcapitatumgroup were treated withPolygonumcapitatumirrigation for two weeks; HE staining was adopted to evaluate the Acute gastritis inflammation damage level, ELISA to test IFN-γ and IL-4 content of three groups; real time-PCR to test relative expression level of IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA in mucositis. Result: After treatment, gastric inflammation inPolygonumcapitatumgroup was improved obviously. The mRNA expression and the serum content of IFN-γ inPolygonumcapitatumgroup were significantly lower than the model group, it was statistically significant (P<0.05). ButPolygonumcapitatumhad little effect on secretion IL-4 in the process of H.pylori infection. Conclusion:Polygonumcapitatumcould inhibitH.pylori-associated gastritis probably via down-regulation of IFN-γ mRNA expression.

Polygonumcapitatum;Miao medicine;Helicobacterpyloric; interferon-γ; interleukin-4; inflammation; rats,Sprague-Dawley

貴州省科學技術基金[黔科合(2014)2027號]； 貴州省科技合作計劃基金[黔科合LH(2015)7417號]； 貴州省衛生計生委科學技術基金(gzwikj2015-1-003)； 貴陽市科技局計劃項目[筑科合同(2014001)]

E-mail:418611578@qq.com

R931

A

1000-2707(2016)09-1037-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.011

**貴陽醫學院2013級碩士研究生

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網絡出版時間：2016-09-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.018.html