不同糖對擬南芥種子萌發和sscd1突變體細胞死亡的影響

黃 弈， 支添添， 任春梅,2*

(1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128)

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不同糖對擬南芥種子萌發和sscd1突變體細胞死亡的影響

黃 弈1， 支添添1， 任春梅1,2*

(1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128)

[目的]比較不同糖對擬南芥種子萌發以及sscd1突變體細胞死亡的影響。[方法]以擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體為材料，在培養基中外源添加蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖，比較不同糖對擬南芥種子萌發和sscd1突變體細胞死亡的影響。[結果]在120 mmol/L濃度范圍內，蔗糖、葡萄糖和果糖對擬南芥種子的萌發無顯著影響，而麥芽糖對種子萌發有延遲作用，且糖濃度越高延遲作用越顯著。120 mmol/L不同糖對sscd1突變體細胞死亡的抑制效果有顯著差異，抑制效果由高到低依次為麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖。[結論]該研究為深入研究糖代謝途徑調控酪氨酸降解途徑的機理提供理論依據。

糖；擬南芥；sscd1突變體；細胞死亡

筆者在前期研究中通過EMS誘導法分離了一種在短日照條件下(8 h光照/16 h黑暗)發生細胞死亡的擬南芥突變體sscd1(short-day sensitive cell death1)[1]。這種突變體在短日照條件下的MS培養基上萌芽，葉片會出現先萎蔫后白化的現象。采用臺盼藍染色的方法研究萎蔫及白化苗的死亡情況，結果證實，突變體sscd1萎蔫處發生細胞死亡[2]。通過基因定位和序列分析發現sscd1基因編碼酪氨酸降解途徑的最后一個酶——延胡索酰乙酰乙酸酶(fumarylacetoacetate hydrolase，FAH)。酪氨酸降解途徑在動物中是必不可少的， FAH缺失會導致動物先天性致死。然而，酪氨酸降解途徑在植物中的作用仍有待闡明[3-6]。在培養基中外源添加糖之后，sscd1突變體細胞死亡的表型有所恢復[7]。糖類是植物體內重要的碳源和能源，它不僅參與能量代謝，還調控植物的生長發育和生理過程，包括在種子萌發、幼苗生根、胚胎發育和衰老等發育過程中都起到了重要作用[8-9]。筆者嘗試添加同一濃度不同糖如蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖，觀察擬南芥種子的萌發以及sscd1突變體細胞死亡情況，比較不同糖對擬南芥種子萌發以及sscd1突變體細胞死亡的影響，為深入研究糖代謝途徑調控酪氨酸降解途徑的機理提供理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型Col-0和sscd1突變體，由作物基因工程湖南省重點實驗室植物信號轉導課題組保存。

1.2試劑與儀器蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和瓊脂粉購自國藥公司。智能人工氣候箱：PRX-450B。

1.3培養方法用消毒液(20% bleach+0.1% Triton100)將Col-0野生型和sscd1突變體種子浸泡8～10 min后，用無菌水清洗3～4次，分別鋪種在含有0、30、60、120 mmol/L蔗糖(Suc)、葡萄糖(Glc)、果糖(Fru)、麥芽糖(Mal)的MS固體培養基上，4 ℃下春化3 d后轉入8 h光照/16 h黑暗的人工氣候箱，培養溫度(23±2)℃，光照強度80～120 μmol/(m2·s)，相對濕度65%。

1.4測定指標與方法①以種子露出白色胚芽為萌發標志，對2、4、6 d的萌發情況進行統計。②以葉片完全白化為細胞死亡標志，對12 d的細胞死亡情況進行統計。

2　結果與分析

2.1不同糖對擬南芥種子萌發的影響以MS培養基為對照，分別在外源添加0、30、60和120 mmol/L的蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖的培養基上鋪種擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體，轉入短日照條件下生長，分別對2、4、6 d的種子萌發率進行統計，結果見圖1。由圖1可知，在外源添加蔗糖、葡萄糖和果糖的培養基中，擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體種子在第2天幾乎完全萌發，且在120 mmol/L糖濃度范圍內的萌發率差別不大；而在30 mmol/L麥芽糖作用下，相對于其他3種糖，2 d時種子的萌發率有一定程度的降低，且在120 mmol/L濃度范圍內，麥芽糖濃度越高，萌發率越低，但生長6 d后，種子幾乎完全萌發。這表明在120 mmol/L濃度范圍內，蔗糖、葡萄糖和果糖對擬南芥種子的萌發并無顯著影響；而麥芽糖對擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體種子的萌發均有延遲作用，且隨著麥芽糖濃度的升高，這種延遲作用更加顯著。

圖1　外源添加不同糖的擬南芥種子萌發情況Fig.1　Germination situation of Arabidopsis seedlings with different sugars

2.2不同糖對sscd1突變體細胞死亡的影響在前期研究中發現，在培養基中外源添加糖后，擬南芥sscd1突變體細胞死亡的表型有所恢復[7]。為了分析不同糖對擬南芥sscd1突變體細胞死亡的影響，分別在含有30和120 mmol/L蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖的培養基上鋪種擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體，轉入短日照條件下生長12 d后對細胞死亡表型進行觀察，結果見圖2。由圖2可知，添加30 mmol/L不同糖的培養基上，擬南芥sscd1突變體幼苗大部分仍出現細胞死亡的表型；而在添加120 mmol/L不同糖的培養基上，擬南芥sscd1突變體的細胞死亡表型有不同程度的恢復。

注：C.Col-0野生型；S.sscd1突變體。Note:C.Col-0 wild type; S.sscd1 mutant.圖2　外源添加不同糖的擬南芥幼苗細胞死亡表型Fig.2　Cell death phenotype in Arabidopsis seedlings with different sugars

為了比較不同糖抑制擬南芥sscd1突變體細胞死亡的差異，進一步對不同濃度糖作用下擬南芥sscd1突變體的細胞死亡率進行統計，結果見圖3。由圖3可知，外源添加30 mmol/L葡萄糖和果糖的培養基上，sscd1突變體的細胞死亡率約為91%，與無糖對照相比無明顯差別；外源添加30 mmol/L的蔗糖和麥芽糖的培養基上，sscd1突變體細胞死亡率約為83%，與葡萄糖和果糖相比有一定程度的降低，但不顯著。在外源添加120 mmol/L糖的培養基上，相對于無糖以及添加30 mmol/L糖的培養基，sscd1突變體的細胞死亡率均顯著降低，且不同糖對sscd1突變體細胞死亡的抑制效果有明顯差異，其中，麥芽糖的抑制效果最好，其次是蔗糖、葡萄糖和果糖。這表明30 mmol/L不同糖對sscd1突變體的細胞死亡有一定程度的抑制，但抑制效果無明顯差別。120 mmol/L糖對擬南芥sscd1突變體細胞死亡的抑制效果顯著，且不同糖對sscd1突變體細胞死亡的抑制效果有明顯差異，抑制效果由高到低依次為麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖。

圖3　外源添加不同糖的擬南芥sscd1突變體細胞死亡率Fig.3　Morality rate of Arabidopsis sscd1 mutant cells with adding different sugars

3　結論與討論

該試驗通過觀察外源添加不同糖的培養基中擬南芥Col-0野生型和sscd1突變體的萌發和sscd1突變體細胞死亡情況，比較不同糖對擬南芥種子萌發以及sscd1突變體細胞死亡的影響。結果表明，在120 mmol/L濃度范圍內，蔗糖、葡萄糖和果糖對擬南芥種子萌發無顯著影響，而麥芽糖對Col-0野生型以及sscd1突變體種子的萌發均有延遲作用，且糖濃度越高，延遲作用越顯著。其次，在培養基中外源添加120 mmol/L 糖時，不同糖對擬南芥sscd1突變體細胞死亡的抑制效果有顯著差異，其中，麥芽糖的抑制效果最好，其次是蔗糖、葡萄糖和果糖。

前期研究中通過濃度梯度設計確定了1%和4%作為低濃度和高濃度的代表，該試驗通過換算選取30和120 mmol/L作為試驗濃度。該試驗中麥芽糖對擬南芥種子萌發具有延遲作用，但生長一定時間后，大部分種子仍能萌發，但其對萌發后幼苗生長的影響還有待進一步研究。不同糖對擬南芥sscd1突變體細胞死亡的抑制效果有所不同，可能是與不同糖類作為信號分子參與調控植物體內不同的生理過程有關，而麥芽糖與蔗糖的抑制效果明顯優于葡萄糖和果糖，推測可能是由于麥芽糖和蔗糖是二糖，其要水解成單糖才能參與調控植物的生長和發育，具體機制尚不明確。目前對于糖類的研究已取得了一定進展，而關于糖抑制擬南芥sscd1突變體細胞死亡的分子機制以及糖代謝途徑與酪氨酸降解途徑的關系還有待于進一步探討。

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[2] 支添添，周舟，韓成云，等.臺盼藍染色鑒定擬南芥sdl1突變體的細胞死亡[J].作物研究，2013，27(3):217-218.

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Effects of Different Sugars onArabidopsisSeed Germination andsscd1 Mutant Cell Death

HUANG Yi1, ZHI Tian-tian1, REN Chun-mei1,2*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128; 2.Key Laboratory of Crop Gene Engineering of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128)

[Objective] To compare the effects of different sugars onArabidopsisseed germination andsscd1 mutant cell death.[Method] With wide type (Col-0) and the mutantsscd1 as research materials, effects of different sugars onArabidopsisseed germination andsscd1 cell death were compared by adding sucrose, glucose, fructose and maltose in the culture medium.[Result] At the 120 mol/L concentration range, sucrose, glucose and fructose had no significant effects onArabidopsisseed germination, but maltose delayed seed germination.And high sugar concentration had more significant delaying effects.Different sugars at 120 mol/L concentration showed significant differences in the inhibitory effects on sscd1 cell death, and the effects from high to low were in the order of maltose, sucrose, glucose and fructose.[Conclusion] This research provides important foundation for the in-depth mechanism research on regulating of tyrosine degradation pathway by glucose metabolic pathway.

Sugar;Arabidopsis;sscd1 mutant; Cell death

國家自然科學基金項目(30671121)。

黃弈(1990- )，男，湖南株洲人，碩士研究生，研究方向：植物分子遺傳學。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事植物分子遺傳學研究。

2016-06-23

S 188;Q 94

A

0517-6611(2016)23-093-03