CXCR7表達增強促進內皮祖細胞血管生成能力

程鵬，何露清，凌驍，林秀飛，李校堃

（溫州醫科大學　藥學院　中美糖尿病并發癥研究所，浙江　溫州　325035）

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CXCR7表達增強促進內皮祖細胞血管生成能力

程鵬，何露清，凌驍，林秀飛，李校堃

（溫州醫科大學藥學院中美糖尿病并發癥研究所，浙江溫州325035）

目的：考察提高CXCR7表達能否提高內皮祖細胞（EPCs）血管生成能力。方法：利用高表達CXCR7的腺病毒轉染至人臍帶血來源的EPCs，建立CXCR7high-EPCs工程化細胞。比較CXCR7high-EPCs與對照組EPCs在無血清條件下存活、黏附、經基質細胞衍生因子-1（SDF-1）誘導的跨內皮遷移、管樣結構形成以及一氧化氮（NO）生成能力。結果：高表達CXCR7能顯著增強EPCs在無血清條件下細胞存活能力、黏附功能、SDF-1誘導的跨內皮遷移、管樣結構形成以及EPCs生成NO的能力，并且與SDF-1有協同作用。結論：提高CXCR7在人臍帶血來源的EPCs中表達能夠增強其血管生成能力，這為臨床治療血管性疾病提供新思路。

CXCR7；內皮祖細胞；細胞存活；管樣結構形成

早在1997年，內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）就能夠從人的外周血中分離得到［1］。臨床研究表明外周血中EPCs的數量和功能與心血管疾病風險及死亡率呈負相關［2-3］。動物實驗也表明移植骨髓［4］、臍帶血［5］或者外周血［6］來源的EPCs能夠改善心肌缺血以及下肢缺血動物模型的血流再恢復情況。基質細胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）在EPCs參與血管生成中發揮關鍵作用［7-11］。近新研究［12-13］發現：SDF-1的受體CXCR7也參與到SDF-1介導EPCs血管生成的過程中。盡管CXCR7在EPCs中表達量很低，但其介導SDF-1誘導細胞存活、與內皮細胞黏附、形成管樣結構以及合成一氧化氮（NO）等功能不容忽視。本實驗利用攜帶人CXCR7基因的腺病毒轉染EPCs獲得CXCR7高表達的EPCs。通過與空載腺病毒轉染的EPCs進行比較發現：高表達CXCR7的EPCs其存活能力、黏附功能、跨內皮遷移能力、管樣結構形成以及細胞生成NO能力顯著得到提升，證明增強EPCs中CXCR7的表達量將顯著提高細胞血管生成功能。

1　材料和方法

1.1材料 人臍帶血來源于健康產婦；MCDB131培養基購自Gibco公司，人淋巴細胞分離液、荊豆凝集素（FITC-UEA-1）購自Sigma公司，EGM-2培養基購自Lonza公司，乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）購自BT公司，MTT檢測試劑盒購自凱基生物公司，CXCR7抗體購自Cell Signaling公司，基質膠購自Corning公司，NO檢測試劑盒購自Promega公司；本實驗用到超凈臺、細胞孵育箱、流式細胞儀、倒置顯微鏡、熒光倒置顯微鏡、電子天平、細胞超生破碎儀。

1.2方法

1.2.1EPCs的分離與培養：無菌條件下用抗凝血袋獲取人臍帶血約100 mL，用MCDB131培養基按1∶1的體積比稀釋血液，將等體積的人淋巴細胞分離液Histopaque 1077輕微緩慢加至血液上層；500×g離心30 min，取中間白膜層細胞；培養基洗滌細胞后加入Single-Quots的EGM-2（含10% FBS）培養基重懸；鋪板于預先用2 μg/cm2人纖維粘連蛋白包被的細胞培養皿中。培養的前7 d每天換液，之后每2 d 換1次液，顯微鏡下觀察細胞形態并攝像。

1.2.2EPCs的鑒定：待EPCs傳代后對其進行鑒定，利用細胞免疫熒光實驗對細胞中EPCs特異性表面標記CD133及VEGFR-2的表達情況進行檢測，并通過Dil-ac-LDL攝取實驗和FITC-UEA-1結合實驗對細胞進行EPCs內皮功能鑒定。

1.2.3轉染：利用實驗室設計的攜帶人CXCR7基因的腺病毒對EPCs進行轉染，空載腺病毒轉染EPCs作為陰性對照組。轉染48 h后，利用免疫印跡實驗檢測EPCs中CXCR7的表達情況。

1.2.4EPCs凋亡檢測實驗：CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs培養至細胞密度達80%，并可進行細胞凋亡實驗。實驗分組情況：CXCR7high-EPCs組和ctrl-EPCs組用無血清的MCDB131培養基進行實驗；CXCR7high-EPCs+SDF-1組和ctrl-EPCs+SDF-1組用含100 ng/mL SDF-1的無血清MCDB131培養基進行凋亡實驗。EPCs培養48 h后，消化并收集，再用冰冷PBS洗滌2次，采用MTT檢測試劑盒并利用流式細胞計數儀檢測EPCs凋亡情況。

1.2.5EPCs黏附實驗：原代培養出來的人臍靜脈內皮細胞以1×105/孔的密度鋪板于細胞24孔板中，培養至完全融合；用含有10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL IL-1β的MCDB131培養基處理EPCs 5 h，活化內皮細胞單層；實驗分組：CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs加至活化的內皮細胞單層上，加入不含血清的MCDB131；在CXCR7high-EPCs+SDF-1組和ctrl-EPCs+SDF-1實驗組中加入含100 ng/mL SDF-1（Peprotech公司）的無血清MCDB131，37 ℃孵育15 min。實驗結束后把未黏附的細胞用PBS洗去；熒光顯微鏡下觀察，每個孔隨機選取5個視野，對發綠色熒光的細胞進行計數統計。

1.2.6EPCs跨內皮遷移實驗：將原代培養的人臍靜脈內皮細胞以每孔5×104的密度鋪板于細胞24孔板的transwell上腔，然后放在24孔板中培養至完全融合；取對數生長期的EPCs進行消化，PBS重懸；進行細胞計數，盡量保證各組別細胞數量一致；把EPCs加到transwell上腔。往CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs組的transwell下腔中加入無血清的MCDB131，往CXCR7high-EPCs+SDF-1和ctrl-EPCs+SDF-1組的transwell下腔中加入含有100 ng/mL SDF-1的無血清MCDB131，37 ℃孵育12 h，使EPCs穿過內皮細胞單層和transwell膜；孵育12 h后，取出transwell小室，用棉棒刮盡上腔中的細胞。熒光顯微鏡下，每個transwell孔隨機選取5個不同視野，對穿過transwell發綠色熒光的細胞進行計數統計。

1.2.7EPCs管樣結構形成實驗：將包埋于碎冰中的基質膠放在4 ℃過夜解凍；移液器槍頭，48孔板也放在4 ℃預冷；待第2天實驗時向預冷的48孔板中每孔加入125 μL基質膠，“8”字型搖動孔板，使膠鋪平，放入細胞培養箱中預熱30 min，使基質膠充分凝固聚合；取對數生長期的EPCs用無血清MCDB131饑餓處理12 h，排除EGM-2培養基中血清以及生長因子對后續實驗的干擾；CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs組別中加入無血清MCDB131；CXCR7high-EPCs+SDF-1和ctrl-EPCs+SDF-1組別中加入含100 ng/mL SDF-1的無血清MCDB131，充分混勻后以每孔2.5×105/mL的細胞密度取250 μL細胞懸液加入48孔板中，37 ℃培養12～24 h。隨后把孔板放在光學顯微鏡下觀察、拍照，用Image J測量管樣結構的長度并進行統計學分析。

1.2.8EPCs NO檢測實驗：取各實驗組細胞上清液50 μL，加入50 μL Griess Reagent I進行后續測試。空白對照組加60 μL樣品稀釋液，標準品組加60 μL標準品，實驗各組加60 μL各組細胞上清液，將5 μL的NADPH（2 mmol/L）加至所有組別，隨后各組加Nitrate Reductase 5 μL，充分混勻，37 ℃孵育30 min；孵育結束后，各組加入10 μL的LDH Buffer，接著加入10 μL的LDH，充分混勻，37 ℃孵育30 min；各組中加入Griess Reagent I、Griess Reagent I I 50 μL，充分混勻后室溫孵育10 min，酶標儀在540 nm檢測吸光度。進行數據統計學分析。

1.3統計學處理方法 采用SPSS18.0軟件進行統計學處理。實驗數據以±s表示，同一實驗多組間的差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1EPCs的分離與培養結果 分離的細胞在人纖維黏連蛋白包被的培養皿中培養7 d后，開始出現典型的細胞集落，隨后原本梭形的細胞逐漸消失，最終成鋪路石樣（見圖1A）。通過EPCs特異性表面標記抗體CD133和VEGFR2鑒定該細胞，并運用攝取Dil-ac-LDL和結合FITC-UEA-1來鑒定細胞的內皮功能。結果表明原代分離的細胞能夠攝取Dil-ac-LDL以及結合FITC-UEA-1（見圖1B），并且該種細胞大都表現出CD133和VEGFR2雙陽性（見圖1C），從人臍帶血分離的單個核細胞經過誘導培養可以獲得高純度的EPCs。

圖1　EPCs的分離與培養

2.2腺病毒轉染獲得CXCR7高表達的EPCs 利用實驗室構建的攜帶人CXCR7基因的腺病毒和空腺病毒轉染EPCs，獲得CXCR7high-EPCs和Ctrl-EPCs模型。免疫印跡實驗表明：攜帶人CXCR7基因的腺病毒在轉染EPCs后明顯上調細胞中CXCR7的表達量，但對CXCR4的表達并沒有影響（P＜0.01），見圖2。

2.3提高CXCR7表達增強EPCs存活 不含血清的培養基誘導EPCs凋亡，MTT法檢測活細胞數量，計算細胞凋亡率。結果顯示：在無血清條件下，CXCR7high-EPCs凋亡率比ctrl-EPCs低；加入外源性的SDF-1能夠顯著降低CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs的細胞凋亡率。SDF-1存在時，CXCR7high-EPCs的凋亡率與ctrl-EPCs相比，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。2.4 提高CXCR7表達增強EPCs黏附作用 本研究中通過比較不同CXCR7濃度的EPCs在活化的人臍靜脈內皮細胞表面黏附能力，研究提高EPCs中CXCR7的表達在促進與活化內皮細胞黏附的作用。實驗結果表明：CXCR7high-EPCs與活化內皮細胞的黏附能力要顯著強于ctrl-EPCs；SDF-1能明顯增強CXCR7high-EPCs與ctrl-EPCs與活化的人臍靜脈內皮細胞的黏附功能，且CXCR7high-EPCs的黏附能力比ctrl-EPCs更顯著（見圖4）。

圖2　不同腺病毒轉染對EPCs中CXCR7、CXCR4表達的影響

圖3　不同CXCR7表達水平對EPCs在無血清條件下對細胞凋亡率的影響

圖4　不同CXCR7濃度對EPCs與活化人臍靜脈內皮細胞黏附功能的影響

2.5提高CXCR7表達增強EPCs跨內皮遷移 實驗中通過transwell實驗比較不同CXCR7表達的EPCs跨內皮單層能力，考察提高CXCR7表達能否促進EPCs跨內皮遷移能力。結果顯示：沒有SDF-1存在時，CXCR7high-EPCs與ctrl-EPCs的跨內皮遷移能力沒有顯著差異；在給予SDF-1后，CXCR7high-EPCs與ctrl-EPCs跨內皮遷移能力均得到提升，且CXCR7high-EPCs跨內皮遷移能力也明顯強于ctrl-EPCs（見圖5）。

圖5　不同CXCR7表達水平對EPCs跨內皮遷移能力的作用

2.6提高CXCR7表達增強EPCs管樣結構形成 實驗通過考察不同CXCR7表達水平的EPCs在基質膠中形成管樣結構的能力，研究增加EPCs中CXCR7的表達是否可以促進細胞血管形成。實驗結果證實：CXCR7high-EPCs在基質膠中成管能力顯著高于ctrl-EPCs；SDF-1能顯著促進CXCR7high-EPCs與ctrl-EPCs體外管樣結構的形成。SDF-1存在時，CXCR7high-EPCs管樣結構形成能力強于ctrl-EPCs，但差異無統計學意義（見圖6）。

圖6　不同CXCR7表達水平對EPCs體外管樣結構形成能力的作用

2.7提高CXCR7表達增強EPCs生成NO的能力 通過比較不同CXCR7表達水平的EPCs生成NO的能力，研究增加CXCR7在EPCs中的表達量是否能上調細胞促血管功能。結果顯示：CXCR7high-EPCs組別中NO的含量顯著高于ctrl-EPCs；SDF-1誘導能夠顯著促進CXCR7high-EPCs與ctrl-EPCs產生NO的能力。SDF-1存在的條件下，CXCR7high-EPCs組的NO含量顯著高于ctrl-EPCs，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖7。

3　討論

本實驗利用CXCR7高表達的腺病毒轉染EPCs，成功建立高表達CXCR7的EPCs模型（CXCR7high-EPCs）。研究發現提高CXCR7表達能夠極大程度提高EPCs的存活能力，這與前期研究［13］證明CXCR7單獨介導SDF-1誘導EPCs存活的結論保持一致。本研究中給予細胞外源性SDF-1能顯著增強CXCR7high-EPCs的黏附及跨內皮遷移能力，并能與高表達的CXCR7發揮協同作用，這與前期研究［13］證明CXCR7單獨介導SDF-1誘導EPCs黏附的結論也是一致的，與Zabel等［5］對腫瘤細胞研究結果同樣相符。EPCs黏附及跨內皮遷移能力是生成血管的起始步驟，高表達CXCR7促進EPCs與活化的內皮黏附、跨內皮遷移，很可能是由于增強了細胞的血管生成能力。

圖7　不同CXCR7表達水平對EPCs生成NO能力的影響

實驗中運用管樣結構形成實驗考察提高CXCR7表達對EPCs成血管能力的影響。結果表明：高表達CXCR7的EPCs其管樣結構形成得到顯著增強，并與SDF-1發揮協同作用。Watanabe等［14］在炎癥研究中發現提高CXCR7表達對內皮類細胞血管生成有促進作用，這與本實驗結果相符。最后，通過檢測NO含量，結果也表明轉染CXCR7的EPCs體內NO生成量顯著增加并與SDF-1發揮協同作用，表明CXCR7高表達可能通過提高EPCs合成NO增強其成血管功能。

提高EPCs中CXCR7的表達量顯著提高EPCs的存活能力、與活化內皮的黏附功能、SDF-1介導細胞跨內皮遷移能力、管樣結構形成能力以及NO生成能力，這種作用與SDF-1一起發揮協同效應。提高CXCR7表達很可能是增強EPCs血管生成能力的有效方法，同時也為改造EPCs用于臨床干細胞移植治療血管性疾病提供新思路。

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

Increasing CXCR7 expression in endothelial progenitor cells can enhances its angiogenic capability

CHENG Peng, HE Luqing, LING Xiao, LIN Xiufei, LI Xiaokun. Sine-American Research Institute for Diabetic Complication, School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate whether increasing CXCR7 expression in endothelial progenitor cells （EPCs） can improve its angiogenic capability. Methods: CXCR7high-EPCs were constructed by transfecting with adenovirus carring human CXCR7 gene. The differences between CXCR7high-EPCs and wt-EPC in cell survival under serum deprivation condition， adhesion， SDF-1 induced trans-endothelial migration， tube formation and nitric oxide （NO） production were compared. Results: Compared with ctrl-EPCs， CXCR7high-EPCs has superiority in cell survival under serum-free condition， cell adhension to activated endothelial cells， trans-endothelial migration， tube formation and NO production， which could be further enhanced by SDF-1. Conclusion: Increasing expression of CXCR7 can enhance the angiogenic capacity of EPCs. The performance of present research may provide a new idea for the treatment of vascular diseases.

CXCR7； endothelial progenitor cells； cell survival； tube formation

R96

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.007

2016-02-07

溫州市公益性科技計劃項目（Y20140654）；國家自然科學基金青年基金資助項目（81200239）。

程鵬（1990-），男，浙江杭州人，碩士生。

李校堃，教授，Email：xiaokunli@163.net。