姜黃素衍生物WZ01對哮喘氣道炎癥介質IL-13和組胺及糖皮質激素受體的影響

李園，湛美正，葉樂平，葛仁山，李昌崇

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江　溫州　325027，1.兒童呼吸科；2.科研中心）

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姜黃素衍生物WZ01對哮喘氣道炎癥介質IL-13和組胺及糖皮質激素受體的影響

李園1，湛美正1，葉樂平1，葛仁山2，李昌崇1

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江溫州325027，1.兒童呼吸科；2.科研中心）

目的：研究姜黃素衍生物WZ01對哮喘氣道炎癥反應、白細胞介素（IL）-13、組胺及糖皮質激素受體（GR）的影響，探討WZ01抑制哮喘氣道炎癥的機制。方法：30只小鼠，隨機分為：正常對照組、哮喘組、低劑量WZ01組、中劑量WZ01組、高劑量WZ01組，每組6只。在第21～第27天1%卵清白蛋白（OVA）霧化激發，每次霧化前30 min予腹腔注射相應劑量0.9%氯化鈉溶液或WZ01。末次激發24 h內，麻醉并處死小鼠，留取肺組織標本HE染色檢測炎癥病理改變，留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）進行細胞分類計數，ELISA法檢測IL-13和組胺濃度，Western blot和免疫組織化學染色檢測肺組織GR蛋白的表達。結果：與正常對照組比較，哮喘組小鼠氣道周圍可見明顯炎癥細胞浸潤及黏液分泌，BALF中炎癥細胞數量、IL-13及組胺水平均顯著升高（P＜0.01）。與哮喘組相比，各劑量WZ01組氣道周圍炎癥細胞浸潤及黏液分泌顯著減少，BALF中淋巴細胞和嗜酸性粒細胞數量明顯減少，BALF中IL-13和組胺濃度顯著下降，差異均有統計學意義（P＜0.01）；BALF中淋巴細胞數量與IL-13和組胺濃度均呈顯著正相關（r值分別為0.886、0.886，P均＜0.01），嗜酸性粒細胞數量與IL-13和組胺濃度均呈顯著正相關（r值分別為0.897、0.898，P均＜0.01）。Western blot和免疫組織化學染色結果顯示，哮喘小鼠肺組織GR表達明顯降低，與哮喘組相比，不同劑量WZ01均能顯著上調哮喘小鼠肺組織GR表達水平。結論：姜黃素衍生物WZ01可顯著抑制哮喘氣道炎癥細胞浸潤和黏液分泌，可能與其降低炎癥介質IL-13和組胺濃度及上調哮喘小鼠肺組織GR表達水平有關，WZ01可能有望成為防治哮喘氣道炎癥的新藥。

哮喘；姜黃素衍生物WZ01；白細胞介素13；組胺；糖皮質激素受體

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞等多種炎癥細胞及炎癥介質參與的氣道炎癥性疾病。2010年全國哮喘流行病學調查顯示，我國哮喘兒童的患病率為3.02%，較十年前翻了一番；同年溫州城區兒童哮喘患病率為3.3%，并呈逐年上升趨勢［1-2］。哮喘時炎癥細胞被募集并活化，釋放白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-13及組胺等多種炎癥介質，誘發并加劇氣道炎癥反應［3］。糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）與有活性的糖皮質激素結合并進入細胞核而發揮抗炎作用［4］。許多哮喘患者GR表達常下調，是導致糖皮質激素療效不佳的重要因素之一。因此，如何上調哮喘患者GR的表達，恢復糖皮質激素的藥物敏感性，是哮喘治療研究的重要課題。WZ01是本課題組新研發的姜黃素衍生物，在代謝綜合征動物模型中顯示出強大的抗炎效應［5］，但在哮喘中的作用尚未見報道。因此，本研究對WZ01在哮喘小鼠氣道炎癥中的影響及對炎癥介質IL-13和組胺濃度及GR的調節進行了初步探討，旨在為進一步臨床應用提供實驗依據。

1　材料和方法

1.1實驗材料 卵清白蛋白（ovalbumini，OVA）購自美國Sigma公司，ELISA試劑盒（組胺、IL-13）購自上海西唐生物科技有限公司，瑞氏-吉姆薩染色試劑盒購自南昌雨露實驗器材有限公司，姜黃素衍生物WZ01為我院科研中心葛仁山教授惠贈，余試劑均為市售分析純。

1.2哮喘模型的制備與分組 30只4周齡SPF級 BALB/c小鼠購自上海史萊克動物實驗公司（動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002），適應性飼養1周后隨機分為5組：正常對照組組、哮喘組、低劑量（10 mg/kg）WZ01組、中劑量（15 mg/kg）WZ01組、高劑量（20 mg/kg）WZ01組。哮喘造模參照Chong等［6］的方法分為致敏和激發2個階段：第7天和第14天分別予0.1% OVA+Al（OH）3凝膠0.1 mL腹腔注射致敏，第21天起將各組小鼠置入有機玻璃霧化箱內予1% OVA溶液霧化激發，每次30 min，持續7 d。正常組以0.9%氯化鈉溶液替代。各組霧化前30 min予腹腔注射相應劑量藥物。本實驗通過本院動物倫理委員會批準。

1.3標本留取及肺組織病理檢查 末次激發24 h內，腹腔注射10%水合氯醛溶液4 mL/kg麻醉后，眼球摘除取血并處死。暴露胸腔后結扎右側主氣管，200 μL PBS灌洗左肺3次，保證每次灌洗液回收率大于90%（如標本不合格則廢棄），收集于1.5 mL EP管內，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液置-80 ℃保存備用。留取右肺固定、包埋后蘇木素-伊紅（HE）染色。

1.4支氣管肺泡灌洗液（BALF）細胞分類計數 50 μL PBS重懸離心后BALF中細胞沉淀，滴于干凈載玻片上涂片，待干燥后瑞氏-吉姆薩染色，顯微鏡下觀察細胞形態并計數。每張玻片由同一名觀察者在光鏡下（×200）隨機選擇10個視野，分別計算各細胞的數量。取平均值作為該片計量值。

1.5ELISA法測BALF中IL-13和組胺濃度 每孔各加入標準品或待測樣品100 μL，將反應板充分混勻后置37 ℃ 40 min。用洗滌液將反應板洗滌4～6次，印干。每孔加入蒸餾水和一抗工作液各50 μL（空白除外），充分混勻后置37 ℃ 20 min。再次用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次。每孔加酶標抗體工作液100 μL，置37 ℃ 10 min，再次洗板，印干。每孔加入底物工作液100 μL，暗處37 ℃反應15 min。每孔加入100 μL終止液混勻，30 min內用酶標儀在450 nm處測吸光值。

1.6Western blot法檢測GR蛋白表達 每組各稱取50 mg肺組織，加入500 μL細胞裂解液后置于勻質器中勻漿，常規方法提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，加入5×loading buffer并調整蛋白濃度至2.5 μg/μL，100 ℃加熱10 min，-20 ℃保存。在10% SDS-PAGE電泳膠孔道中分別加入各組蛋白20 μL，濕轉法將蛋白轉移至0.45 nm的PVDF膜上，轉膜完畢后置于5%牛奶中封閉1～2 h，TBST洗滌3次后，一抗孵育過夜，α-tublin（碧云天公司）工作濃度為1∶5 000，GR（Abcam公司）工作濃度為1∶1 000。TBST洗滌后，相應二抗室溫孵育1 h，再次TBST洗滌后置于干凈透明玻璃板均勻滴上ECL發光液，迅速置于曝光機中曝光，保存圖像并分析。

1.7免疫組織化學染色（Envision二步法）檢測GR蛋白 留取的肺組織置于二甲苯液、不同濃度梯度的酒精及0.01 mol/L pH值7.4的PBS液脫蠟水化后，置于3%的過氧化氫甲醇液中，采用枸櫞酸鹽（pH值6.0）微波抗原修復，10%的小牛血清封閉非特異性抗原，室溫30 min；滴加GR（Abcam公司，1∶200）一抗工作液，置4 ℃冰箱中過夜后用PBS液洗滌，滴加Envision加強型二抗工作液，室溫下孵育10 min 并PBS液洗滌；滴通用型二抗，37 ℃孵育30 min并PBS洗滌，每片滴加新鮮配制的DAB顯色液顯色，自來水沖洗30 min終止顯色，置于Gill改良蘇木素復染及依次經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察結果。

圖1　小鼠肺組織HE染色（×400）

1.8統計學處理方法 采用GraphPad Prism 5.0 及SPSS19.0軟件進行處理。各組計量資料數據以±s表示，均數間比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），方差齊性者兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnett’s-T3檢驗。兩變量的相關分析采用Pearson直線相關法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組小鼠生物學行為判斷 OVA誘導哮喘急性期小鼠模型建立成功。哮喘組小鼠激發時多表現為呼吸急促、抓耳撓腮、煩躁不安等，嚴重時甚至出現行動遲緩、四肢癱軟等。相較于哮喘組，各劑量WZ01組小鼠激發后癥狀不明顯。正常對照組小鼠無明顯異常。

2.2WZ01抑制哮喘小鼠氣道炎癥反應和黏液分泌正常對照組小鼠氣道和肺泡壁結構完整，氣道及血管周圍無明顯炎癥細胞浸潤，管腔內未見黏液分泌（見圖1A）。哮喘組小鼠氣道及血管周圍和肺泡間隔大量炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞和嗜酸性粒細胞為主，氣道狹窄，高柱狀支氣管上皮細胞增生并分泌大量黏液，堵塞管腔（見圖1B）。與哮喘組相比，各劑量WZ01組均明顯抑制哮喘氣道炎癥反應，表現為氣道、血管周圍和肺泡間隔炎癥細胞浸潤明顯減少，氣道腔內可見少許黏液，以中劑量和高劑量組最為顯著（見圖1C-E）。

2.3WZ01對BALF中炎癥細胞的影響 哮喘組BALF淋巴細胞數計數及比率、嗜酸粒細胞計數及比率均高于正常對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。而低、中、高劑量WZ01組顯著抑制BALF炎癥細胞浸潤，表現為淋巴細胞計數及百分比、嗜酸性粒細胞計數及百分比均明顯低于哮喘組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各WZ01組抑制嗜酸性粒細胞浸潤作用呈劑量依賴性（P＜0.05），見表1。

2.4WZ01對BALF中IL-13和組胺的影響 ELISA結果顯示，哮喘組BALF中IL-13和組胺濃度均較正常對照組升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。相較于哮喘組，低、中、高劑量WZ01組BALF中IL-13水平和組胺濃度均顯著降低（P＜0.01），見表2。

表1　WZ01對哮喘小鼠BALF炎癥細胞的影響（n=6，±s，個/200倍視野）

表1　WZ01對哮喘小鼠BALF炎癥細胞的影響（n=6，±s，個/200倍視野）

與正常對照組比：aP＜0.01；與哮喘組比：bP＜0.01；與低劑量WZ01組比：cP＜0.05，dP＜0.01

組別　淋巴細胞計數　淋巴細胞比率（%）　嗜酸性粒細胞計數　嗜酸性粒細胞比率（%）正常對照組8.92±1.94　14.58±1.620.91±0.37　1.260±0.52哮喘組　40.76±4.61a　30.26±0.82a　12.25±0.98a　8.370±0.75a低劑量WZ01組　19.47±3.94ab　21.65±2.29ab5.77±0.78ab　5.630±0.64ab中劑量WZ01組　13.25±3.21bc　17.80±2.40ab4.01±0.78abd　4.630±0.65ab高劑量WZ01組　11.92±3.46bd　17.17±3.71abc3.29±0.65abd　4.032±0.69abd

2.5相關性分析 BLAF中淋巴細胞數量與IL-13、組胺濃度呈顯著正相關（分別r=0.886，r=0.886，均P＜0.01），嗜酸性粒細胞數量與IL-13、組胺濃度亦呈顯著正相關（分別r=0.897，r=0.898，均P＜ 0.01）。

2.6WZ01對肺組織GR表達的影響 Western blot結果顯示，各劑量WZ01組能顯著上調肺組織GR蛋白的表達（見圖2）；免疫組織化學染色結果表明，與正常對照組相比，哮喘組支氣管上皮細胞胞漿和胞核GR表達水平顯著下降，而不同劑量WZ01處理后，支氣管上皮細胞胞漿和胞核GR表達水平上調（見圖3）。

表2　各組BALF中IL-13和組胺濃度比較（n=6，±s，pg/mL）

表2　各組BALF中IL-13和組胺濃度比較（n=6，±s，pg/mL）

與正常對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與哮喘組比：cP＜0.01；與低劑量WZ01組比：dP＜0.05

組別 IL-13 組胺正常對照組　16.93± 4.3293.50±18.98哮喘組　74.75±11.26b　447.70±44.17b低劑量WZ01組　43.69±7.91bc　269.30±76.43bc中劑量WZ01組　35.32±7.32bc　195.20±36.76ac高劑量WZ01組　21.86±9.51cd　160.10±56.61cd

圖2　Western blot法檢測各組GR的表達

圖3　免疫組織化學染色檢測各組支氣管上皮細胞胞漿和胞核GR表達水平（Envision，×400）

3　討論

姜黃素是姜科植物姜黃的主要活性物質，具有強效抗炎作用，其通過抑制一氧化氮、核因子-κB （NF-κB）、Notch1-GATA3等炎癥相關信號通路而抑制氣道和肺組織的急慢性炎癥及氣道高反應性［6-8］。在高脂飲食誘導的代謝綜合征大鼠中，姜黃素衍生物WZ01較姜黃素有更顯著的抗炎效果［4］。炎癥細胞浸潤在哮喘黏液栓形成、氣道高反應、氣道重塑等病理過程中起重要作用，如嗜酸性粒細胞浸潤與氣道重塑密切相關［9-10］，B淋巴細胞在哮喘氣道炎癥反應、2型輔助性T淋巴細胞（Th2細胞）的產生和氣道高反應性等過程中起關鍵作用［11］。本研究HE結果顯示，哮喘組小鼠氣道、血管周圍和肺泡間隔大量淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，氣道腔內黏液分泌明顯增多甚至堵塞管腔，而低、中、高劑量WZ01均可顯著抑制炎癥細胞浸潤及黏液分泌。BALF細胞分類計數也表明，WZ01明顯抑制BALF淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞滲出。因此，WZ01在哮喘小鼠中顯示出強效抗炎效應。

IL-13是Th2細胞分泌的重要的炎癥介質，其表達水平與哮喘嚴重程度呈正相關，可作為哮喘嚴重程度指標之一［12］。霧化吸入IL-13可誘導新西蘭白兔出現氣道高反應、氣道炎癥細胞（尤其是嗜酸性粒細胞）浸潤、黏液分泌等類哮喘癥狀［13］。IL-13主要通過刺激細胞外基質蛋白分泌、增加黏蛋白生成及協同IL-4、IL-5募集活化肥大細胞和嗜酸性粒細胞等多種方式促進哮喘發生、發展［14-16］。阻斷IL-13相關信號通路中任意一個環節可能抑制氣道高反應及炎癥反應［17-18］。組胺主要由肥大細胞和嗜堿性粒細胞存儲和釋放，是最早發現的與哮喘密切相關的炎癥介質之一，氣道中組胺水平升高可明顯加劇氣道內炎癥反應［19］。抑制組胺釋放或阻斷其與特異受體結合可改善哮喘氣道炎癥、黏液高分泌、肺通氣功能和氣道重塑［20-21］。研究發現，OVA誘導小鼠哮喘肺組織GR表達下降，運動可增加GR表達并減輕氣道炎癥和改善氣道重塑［22］；糖皮質激素耐藥的兒童的B淋巴細胞胞核內GR比糖皮質激素敏感的兒童的B淋巴細胞胞核內GR表達水平更低且降解更快［23］，而提高糖皮質激素表達水平可顯著提高哮喘治療效果［24］，這提示上調GR可作為潛在的哮喘治療靶點。本研究結果表明，各劑量組特別是高劑量WZ01組不僅明顯抑制哮喘小鼠氣道炎癥細胞浸潤及黏液分泌，而且顯著降低BALF中IL-13和組胺濃度，BLAF中淋巴細胞和嗜酸性粒細胞數量與IL-13、組胺濃度呈顯著正相關；同時，各劑量WZ01能顯著上調哮喘小鼠肺組織GR表達水平。其機制可能是，WZ01通過抑制淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞募集，阻斷炎癥介質IL-13和組胺的釋放，進而阻斷了炎癥細胞釋放炎癥介質和炎癥介質募集活化炎癥細胞之間的惡性循環，同時顯著上調肺組織GR表達水平，改善了哮喘氣道炎癥細胞浸潤、黏液分泌等病理改變，最終在哮喘中起到強大的抗炎、抗過敏作用。因此，本研究首次發現并初步揭示了WZ01在哮喘治療中抗炎、抗過敏的機制，具有十分重要的潛在臨床應用價值。但本研究小鼠樣本數相對較少，且哮喘的分子機制十分復雜，因此，對WZ01在哮喘中的作用及分子機制有待深入研究。

綜上所述，WZ01不僅明顯抑制哮喘小鼠氣道炎癥細胞浸潤及黏液分泌，而且顯著降低BALF中IL-13和組胺濃度，阻斷炎癥細胞釋放炎癥介質和炎癥介質募集活化炎癥細胞之間的惡性循環，上調肺組織GR蛋白表達水平，最終發揮顯著抗炎作用，極具臨床應用價值。因此，進一步深入闡明WZ01調控哮喘炎癥反應及炎癥介質的分子機制可為其臨床應用提供理論基礎。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Effects of curcumin derivative WZ01 on asthmatic airway infl ammatory mediators IL-13, histamine and glucocorticoid receptor

LI Yuan1, ZHAN Meizheng1, YE Leping1, GE Renshan2, LI Changchong1. 1.Department of Pediatric Pulmonology, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Research Center, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To investigate the effects of curcumin derivative WZ01 on asthmatic airway infl ammation， infl ammatory mediators IL-13 and histamine， and glucocorticoid receptor （GR）. Methods: Thirty mice were randomly divided into： control group， asthma group， low dose WZ01 group， moderate dose WZ01 group and high dose WZ01 group. Each group was 6 mice， respectively. After sensitized with OVA， the mice were challenging with 1% OVA from the 21th to 27th day. Each mouse was intraperitoneally injected with corresponding drugs or normal saline half an hour before atomizing. After the last challenging， mice were anesthetized and sacrifi ced within 24 hours， lung tissues were obtained for detecting infl ammatory alteration with hematoxylin-eosin staining， and the BALF for cellular classifi cation and counting and the concentrations of IL-13 and histamine by ELISA assay， the expression of GR in lung tissues was detected with immumohistochemical staining and Western blot. Results: Compared with the normal control group， HE staining showed massive infl ammatory cellular infi ltration and mucous secretion accumulated in the asthma group， ELISA analysis showed signifi cantly increased number of infl ammatory cells and concentrations of IL-13 and histamine in the BALF （P＜0.01）. Compared withthe asthma group， each dose of WZ01 markedly inhibited the infl ammatory cellular infi ltration and mucous secretion in the airway； In each dose WZ01 group， the number of lymphocytes and eosinophils in BALF were distinctly decreased （P＜0.01）， accompanied by the remarkable decline of the concentrations of IL-13 and histamine （P＜0.01）； the number of lymphocytes had remarkably positive relationships with the concentrations of IL-13 and histamine in the BALF （r values were 0.886 and 0.886， respectively， P＜0.01）. The number of esoinophils had also remarkably positive relationships with the concentrations of IL-13 and histamine in the BALF （r values were 0.897 and 0.898， respectively， P＜0.01）. The results of immumohistochemical staining and Western blot showed that GR expression in the lung tissues of asthmatic mice was decrease. Compare with the asthma group， different doses of WZ01 could predominantly reverse and up-regulate the expression of GR in the lung tissues of asthmatic mice. Conclusion: WZ01 can signifi cantly inhibit the infl ammatory cellular infi ltration and mucus secretion in asthma，which may be attributable to the decline of the infl ammatory mediators IL-13 and histamine and the up-regulated expression of GR in the lung tissues of asthmatic mice. WZ01 may be a new drug of prevention and treatment for airway infl ammation in asthma.

asthma； curcumin derivative WZ01； interleuterkin 13； histamine； glucocorticoid receptor

R725.6

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.005

2016-01-31

浙江省自然科學基金資助項目（LY14H010004）；浙江省“錢江人才計劃”項目（QJD1402012）；2015年度溫州市高層次人才創新技術重點資助項目。

李園（1989-），女，廣西南寧人，碩士生。

葉樂平，教授，主任醫師，碩士生導師，Email：yeleping@163.com。