齊墩果酸抑制地佐環平誘導的小鼠精神分裂癥的實驗研究

陳德沈，劉立瀅，陳策，張偉，林崇光

（溫州市第七人民醫院　精神科，浙江　溫州　325000）

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齊墩果酸抑制地佐環平誘導的小鼠精神分裂癥的實驗研究

陳德沈，劉立瀅，陳策，張偉，林崇光

（溫州市第七人民醫院精神科，浙江溫州325000）

目的：觀察齊墩果酸在NMDA受體拮抗劑地佐環平（MK-801）誘導的小鼠精神分裂樣行為中的作用。方法：小鼠口服給予齊墩果酸，觀察MK-801誘導的小鼠精神分裂樣行為反應，包括曠場實驗、聽覺驚嚇反射（ASR）實驗和新物體識別反應。結果：MK-801處理的小鼠在曠場實驗中表現出過度的興奮性運動，而單次給予齊墩果酸阻斷了這一作用。齊墩果酸本身對小鼠ASR或前脈沖抑制（PPI）沒有影響，卻可以減輕MK-801誘導的前脈沖缺陷。在新物體辨識實驗中，單次給予齊墩果酸同樣可以逆轉MK-801誘導的小鼠注意力和識別記憶損傷。此外，齊墩果酸抑制MK-801對前額葉Akt、GSK3β信號通路的激活。結論：齊墩果酸可以作為治療嚴重精神分裂癥如陽性癥狀、感覺門控失調、意識損傷的候選藥物。

齊墩果酸；精神分裂；地佐環平；小鼠

精神分裂癥牽涉到多巴胺能、谷氨酸能、氨基丁酸能神經傳導異常［1-2］。大多數阻斷多巴胺D2受體的抗精神類藥物（經典的或非經典的）被批準用于治療精神分裂癥，但是這些藥都存在各種不良反應，如錐體外癥候群或代謝癥候群［1］。有報道［3］指出夏枯草的提取物可以調控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）-糖原合成激酶（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）信號通路，逆轉由地佐環平（MK-801）誘導的小鼠精神分裂樣行為異常。為了進一步鑒別夏枯草提取物中的活性成分，我們成功分離出數種活性成分，包括齊墩果酸（3β-3-Hydroxyolean-12-en-28-oic acid）。齊墩果酸為五環三萜類化合物（見圖1），廣泛分布于可食用植物中，具有肝保護、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥用價值［4］，它的這些藥理學作用多與其調控磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/GSK3β信號通路相關［5-6］。蛋白激酶Akt在維持細胞功能中發揮重要作用，包括細胞代謝、細胞周期、突觸可塑性、形成記憶［7］。通過Thr308或Ser473磷酸化位點的磷酸化來激活Akt，并逐步激活下游信號分子，例如GSK3β［8］。GSK3β屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，參與調控糖代謝、生長發育、軸突可塑性等多種生理過程［9］。有報道［10］顯示Akt/GSK3β不僅與精神分裂癥的病理生理密切相關，而且是抗精神病治療的重要靶點。綜合先前研究的發現，我們推測齊墩果酸可能是通過調控Akt/ GSK3β信號軸起到抗精神病的作用。另有報道［11］指出單次給予N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體拮抗劑可以引起多種擬精神病癥狀，因此本研究中利用動物精神分裂癥模型，從多方位研究了齊墩果酸在治療精神分裂癥中的新藥理學活性。

圖1　齊墩果酸結構式

1　材料和方法

1.1實驗動物 所用ICR小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，雄性，25～30 g，6周齡，清潔級，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2010-001。本次動物實驗經溫州市第七人民醫院實驗動物倫理委員會審核批準。動物飼養于溫州市第七人民醫院實驗動物中心，分籠飼養，自由采食飲水，溫度保持在（23± 2）℃，濕度保持在（55±5）%，光照時間為早上7點至晚上7點。

1.2材料 齊墩果酸、MK-801、氯氮平購自美國Sigma公司；Akt抗體、GSK3β抗體購自Santa Cruz公司；AktpSer473抗體（pAkt）、GSK3β pSer9（pGSK3β）抗體購自Cell Signaling公司；其他分析純化學試劑購自國藥集團；小鼠曠場實驗裝置和新物體識別實驗設備均購自上海欣軟信息科技有限公司；動物聽覺驚嚇反射（auditory startle reflex，ASR）系統購自美國Coulbourn公司。

1.3給藥方式 MK-801溶解于0.9%氯化鈉溶液；齊墩果酸懸浮于含10% Tween 80的0.9%氯化鈉溶液；陽性藥氯氮平溶解于含有0.1 N HCl的0.9%氯化鈉溶液中。實驗中每組小鼠數量為10只。行為學測試前30 min腹腔注射0.2 mg/kg MK-801，以誘導小鼠精神分裂癥模型。進行行為學實驗和處死前1 h，分別灌胃給予齊墩果酸（3、10、30 mg/kg），對照組給予等體積含10% Tween 80的0.9%氯化鈉溶液。進行行為學實驗前30 min給予氯氮平（1 mg/kg）。

1.4曠場實驗 小鼠曠場實驗在41.5 cm×41.5 cm ×41.5 cm的反應箱中進行。每次實驗前均用70%乙醇擦拭箱體。將小鼠放置于反應箱中央，攝像機監測30 min內的運動行為，以總移動距離來評判水平自主活動。在曠場實驗前1 h給予小鼠齊墩果酸（3、10、30 mg/kg）或10% Tween 80的0.9%氯化鈉溶液。MK-801在實驗前30 min給予以誘發小鼠過度活動。氯氮平在實驗前30 min給予。

1.5ASR實驗 ASR和前脈沖抑制（prepulse inhibition，PPI）測試在動物ASR系統中完成。將小鼠放入隔音室中，刺激開始后每1 ms記錄65次，以平均振幅作為ASR的評判指標。ASR測試由聲音驚嚇實驗和非刺激實驗組成。ASR測試結束后，PPI測試開始，分為3個實驗類型，分別為單獨的聽覺反射刺激，即在40 ms內120分貝的強噪音刺激；前脈沖實驗聯合單獨聽覺反射刺激，即先給予20 ms 73、76、82、86分貝的前脈沖刺激，間隔80 s，再給予40 ms 120分貝強刺激；非刺激實驗，即僅接受背景音刺激，PPI測試首尾給予5次120分貝的強刺激，中間隨機給予10次前脈沖刺激或非刺激對照，平均刺激間隔為21 s（12～30 s）。實驗開始前先讓動物接受一段5 min 70分貝的適應性刺激。評價指標：PPI=（1-前脈沖聯合驚反射刺激的反應幅度/單獨驚反射刺激的反應幅度）×100，數值為0時表示無PPI，數值越大代表抑制程度越深。提前1 h給予小鼠齊墩果酸（3、10、30 mg/kg）或10% Tween 80的0.9%氯化鈉溶液。MK-801在實驗前30 min給予以引起小鼠感覺門控缺陷。氯氮平在實驗前30 min給予。

1.6新物體識別實驗 先對小鼠進行2 d每天10 min自由探索以熟悉環境，熟悉環境結束24 h后開始正式訓練，有2個完全相同的物體（金屬圓桶）于距盒壁8 cm處沿一方墻直線排開。小鼠自另外2個拐角之一放入盒內，在自由探索5 min后再被送回飼養籠內。待2 h間歇后，小鼠被再引入實驗盒內進行實驗期的自由探索。此時，將其中1個金屬圓桶置換為塑料長方體（二者高度一致）并位于原位，而另一已熟悉過的金屬圓桶被移至新物體相對的拐角以防止小鼠空間的偏倚。如果小鼠用它的鼻子在1 cm之內指向物體或觸及鼻子則被視為探索行為。對熟悉物品的探索時間記為Tfamiliar；新物品記為Tnovel，同時計算分辨指數來評價小鼠對新物體的優先探索能力：（Tnovel-Tfamiliar）/（Tnovel+Tfamiliar）× 100。提前1 h給予小鼠齊墩果酸（3、10、30 mg/kg）或10% Tween 80的0.9%氯化鈉溶液。MK-801在實驗前30 min給予以引起小鼠記憶能力損傷。氯氮平在實驗前30 min給予。

1.7蛋白免疫印跡實驗 給予齊墩果酸（30 mg/ kg）后1 h處死正常小鼠和MK-801處理的實驗組小鼠，分離大腦前皮層。在冰浴的Tris-HCl（20 mmol/L，pH=7.4）溶液中將組織研磨破碎成均質溶液。取15 mg總蛋白進行8% SDS-PAGE凝膠電泳，100 V 4 ℃轉PVDF膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，漂洗后用辣根過氧化物標記的二抗進行在37 ℃孵育1 h，以化學發光方式顯色。使用Image J軟件對條帶進行灰度分析，先計算各樣本磷酸化蛋白pAkt、pGSK3β占各自總蛋白的比重，再將各組平均值與對照組平均值進行歸一化計算。

1.8統計學處理方法 采用Graphpad Prism 5.0軟件進行數據分析。所有數據均以±s表示。行為學數據組間比較采用單因素方差分析或雙因素方差分析。蛋白免疫印跡數據采用t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1齊墩果酸逆轉MK-801誘導的活躍過度 我們首先用曠場實驗檢測了齊墩果酸是否會影響小鼠的基礎運動能力。與對照組相比，3種濃度齊墩果酸組小鼠在每5 min間隔內的移動距離和30 min內的總移動距離差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2AB。氯氮平組與對照組相比差異也無統計學意義（P ＞0.05）。說明齊墩果酸和氯氮平對小鼠的基礎活動能力沒有影響。給予MK-801后，小鼠在每5 min間隔內的移動距離顯著增加（P＜0.001），見圖2C。而聯合使用齊墩果酸或氯氮平可以阻斷MK-801的刺激作用（P＜0.05），見圖2C-D。

2.2齊墩果酸減弱由MK-801導致的PPI缺陷 齊墩果酸組的聽覺反射幅度和前脈沖強度未見明顯變化，氯氮平組也未引起聽覺反射幅度的明顯變化，見表1和圖3A。因此，齊墩果酸和氯氮平對小鼠的震驚反應幅度和PPI并沒有作用。當齊墩果酸和MK-801聯用時，小鼠的聽覺驚嚇幅度顯著降低（P＜0.05）；當氯氮平和MK-801聯用時，小鼠的聽覺驚嚇幅度顯著降低（P＜0.05）。給予MK-801顯著加強了小鼠對120分貝的ASR強度，并且降低所有前脈沖刺激的PPI程度（P＜0.05），見表2和圖3B。

圖2　齊墩果酸對小鼠運動活力的影響

表1　各組小鼠的聽覺驚反射幅度（n=10，±s）

表1　各組小鼠的聽覺驚反射幅度（n=10，±s）

噪音量（分貝）　對照組　齊墩果酸組　氯氮平組3 mg/kg　10 mg/kg　30 mg/kg 80　15.06± 2.28　10.19± 4.55　8.28± 0.94　14.90± 3.06　10.58± 1.68 90　18.50± 3.37　13.94± 1.83　23.38± 6.63　15.67± 2.09　14.06± 2.77 100　47.86± 8.45　35.19± 8.40　53.56±12.21　25.61± 3.94　56.97±10.44 110　105.40±21.77　73.92±16.17　103.50±13.87　90.25±18.71　86.78±13.34 120　150.70±24.30　145.10±33.57　171.30±22.96　149.10±23.75　163.00±17.37

表2　MK-801處理后各組小鼠的聽覺驚反射幅度（n=10，±s）

表2　MK-801處理后各組小鼠的聽覺驚反射幅度（n=10，±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001

噪音量MK-801+氯氮平組3 mg/kg　10 mg/kg　30 mg/kg 80　15.06± 2.28　17.53± 2.87a10.19± 4.55c　8.28± 0.94c14.90± 3.06c10.58± 1.68c90　18.50± 3.37　50.50±11.25a13.94± 1.83c23.38± 6.63c15.67± 2.09c14.06± 2.77c100　47.86± 8.45　87.75±14.49a35.19± 8.40c53.56±12.21c25.61± 3.94c56.97±10.44c110　105.40±21.77　145.50±23.15a73.92±16.17c103.50±13.87c90.25±18.71c86.78±13.34c120　150.70±24.30　243.60±38.27a145.10±33.57c171.30±22.96b149.10±23.75a163.00±17.37c（分貝）　對照組　MK-801組　MK-801+齊墩果酸組

圖3　齊墩果酸對小鼠PPI的影響

2.3齊墩果酸對MK-801誘導的記憶損傷的修復作用 我們首先驗證了齊墩果酸是否會影響正常小鼠的預判能力。在5 min內讓各組小鼠分別對2個相同的物體進行探索，記錄下小鼠對每個物體的嗅探時間，見圖4A。2 h后，再將小鼠放置入識別箱，此時已經將其中1個舊物體替換為新物體，記錄5 min內小鼠對2個物體的嗅探時間，見圖4A。與對照組相比，齊墩果酸組小鼠在嗅探新舊物體的時間長度比例、分辨比及總探索時間差異無統計學意義。與齊墩果酸一樣，給予藥氯氮平對正常小鼠的預判能力也沒有產生影響，見圖4B-D。

給予MK-801后，小鼠嗅探新舊物體的時長比例和分辨比都產生了顯著性影響。與對照組相比，給予MK-801后的實驗組小鼠對新物體的嗅探時間比例和對新舊物體的分辨比顯著下降，說明記憶有損傷。而給予齊墩果酸可以明顯改善MK-801造成的各組小鼠記憶損傷，差異有統計學意義，見圖4E-F。

2.4齊墩果酸抑制MK-801誘導的Akt、GSK3β磷酸化水平升高 齊墩果酸（30 mg/kg）不引起正常小鼠前皮層Akt、GSK3β的磷酸化水平，見圖5A。根據前期研究［3］發現，MK-801明顯上調了小鼠皮層Akt、GSK3β的磷酸化水平，這與MK-801能夠誘導小鼠產生急性擬精神病樣的作用相關。本研究中，MK-801也顯著增加了小鼠前皮層Akt Ser473磷酸化位點、GSK-3β Ser9磷酸化位點的磷酸化程度（P＜0.05），見圖5B。而齊墩果酸（30 mg/kg）抑制了MK-801所引起的Akt、GSK3β磷酸化水平升高，結果差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，MK-801和齊墩果酸對前皮層總Akt和GSK3β水平均不產生影響。

圖4　齊墩果酸對小鼠識別記憶能力的影響

3　討論

陽性癥狀與精神分裂癥患者的多巴胺能系統和谷氨酸能系統間的平衡有密切關系［12］。單次給予MK-801可誘導小鼠在曠場實驗中過度運動行為，其作用可被齊墩果酸（30 mg/kg）或D2/5-HT2A受體拮抗劑氯氮平所阻斷［13］。此外，齊墩果酸不影響正常小鼠在曠場中的運動表現，但是對MK-801所導致的過度運動有抑制作用，而且并不是因為齊墩果酸有鎮靜或催眠作用。

驚嚇反射的PPI是目前在各哺乳動物種系中所公認的一種SG模型［14］。大量研究表明在精神分裂癥患者和動物模型中驚嚇反射的PPI受到破環。在本研究中，齊墩果酸或氯氮平對正常小鼠的ASR和PPI幅度均沒有作用，說明齊墩果酸或氯氮平不影響感覺門控功能。而單次給予MK-801即導致小鼠PPI缺陷，說明感覺運動門控受到破壞，而齊墩果酸可能具有改善精神分裂癥患者感覺運動門控功能損傷的作用。

嚙齒動物對新物體的識別記憶被認為與人類的陳述性（情景）記憶類似，而精神分裂癥患者的此功能異常。本研究發現，MK-801誘導的識別記憶損傷可被齊墩果酸和氯氮平所逆轉，并且單獨給予齊墩果酸不影響正常動物的注意力和識別記憶功能，暗示齊墩果酸可能有助于提高精神分裂癥患者的認知功能。

有報道［15］指出亞慢性給予齊墩果酸展示出抗抑郁樣作用，可能影響了兒茶酚胺代謝。有文獻［16］報道給予大鼠精神興奮劑，如多巴胺受體激動劑、5-HT受體激動劑和NMDA受體拮抗劑，都會引起Akt 或GSK3β的磷酸化升高。我們發現MK-801引起的前皮層Akt和GSK3β磷酸化程度升高可以被單次給予齊墩果酸所抑制。也有報道［17］表明其他抗精神病藥物也有同樣的作用。此外，由于齊墩果酸處理的正常小鼠前皮層Akt和GSK3β磷酸化水平不變，因而我們推測齊墩果酸干預MK-801介導的的生化改變可能是針對于NMDA受體信號通路異常變化。

綜上所述，我們發現齊墩果酸對MK-801誘導的小鼠精神病樣行為有改善作用，例如自發活動過度活躍、PPI缺陷和新物體識別記憶損傷等，其機制與抑制MK-801誘導的前皮層Akt和GSK3β信號通路異常磷酸化有關。這些研究發現齊墩果酸是治療精神分裂癥陽性癥狀和認知癥狀的新型候選藥物。

圖5　齊墩果酸對小鼠前皮層Akt和GSK3β磷酸化水平的影響

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（本文編輯：吳昔昔）

Oleanolic acid attenuates MK-801-induced schizophrenia-like behaviors in mice

CHEN DeshenLIU Liying，CHEN CeZHANG WeiLIN Chongguang.Department of PsychiatryWenzhou Seventh People's Hospital，Wenzhou325000

ObjectiveTo observe the effects of oleanolic acid on schizophrenia-like behaviors in mice elicited by MK-801an N-methyl-D-aspartate （NMDA） receptor antagonist.MethodsEffects of oleanolic acid via oral gavage in MK-801-induced schizophrenia-like response in micesuch as open field testacoustic startle response test and novel object recognition test were all observed.ResultsSinglely administration of oleanolic acid blocked MK-801-induced hyperlocomotion in the open field test.In acoustic startle response testoleanolic acid did not affect the acoustic startle response or prepulse inhibition （PPI） level.And MK-801-induced PPI deficit was ameliorated by oleanolic acid.In novel object recognition testattention and recognition memory impairments induced by MK-801 were reversed by oleanolic acid.Additionallyoleanolic acid normalized the MK-801-induced alterations of signaling moleculesincluding phosphorylation levels of Akt and GSK-3β in frontal cortex.ConclusionThese results suggest that oleanolic acid can be a candidate for the treatment of several symptoms of schizophreniaincluding positive symptomssensorimotor gating disruptionand cognitive impairments.

oleanolic acid； schizophrenia； dizocilpine； mice

R749.3

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.008

2016-01-27

陳德沈（1974-），男，浙江溫州人，主治醫師。