Rho鳥苷交換因子12（ARHGEF12）基因在白血病細(xì)胞生長中的作用研究

高莉，解楊陽，王翔，湯燕靜，湯靜燕，陳靜，沈樹紅

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心　血液/腫瘤科，上海　200127）

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Rho鳥苷交換因子12（ARHGEF12）基因在白血病細(xì)胞生長中的作用研究

高莉，解楊陽，王翔，湯燕靜，湯靜燕，陳靜，沈樹紅

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心血液/腫瘤科，上海200127）

目的：探討Rho鳥苷交換因子12（ARHGEF12）基因?qū)Π籽〖?xì)胞生長的作用及作用機(jī)制。方法：通過實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）對選定的U937、KG1a、ML2、Kasumi-1、THP1白血病細(xì)胞株進(jìn)行ARHGEF12基因表達(dá)的檢測，并用shRNA分別在高表達(dá)及低表達(dá)的白血病細(xì)胞株中敲低ARHGEF12，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的生長及凋亡情況，最后進(jìn)行蛋白激酶芯片分析以發(fā)現(xiàn)相關(guān)作用機(jī)制。結(jié)果：部分白血病細(xì)胞株高表達(dá)ARHGEF12基因，在高表達(dá)的細(xì)胞中敲低ARHGEF12基因會使細(xì)胞生長受抑制，這與敲低后細(xì)胞凋亡增加、增殖抑制相關(guān)，并且和p53、CDK2及p27 Kip1磷酸化相關(guān)。結(jié)論：ARHGEF12對其高表達(dá)的白血病細(xì)胞的生長是必須的，敲低ARHGEF12基因?qū)е掳籽〖?xì)胞凋亡增加、增殖抑制。

ARHGEF12基因；白血病細(xì)胞；凋亡

Rho鳥苷交換因子12（ARHGEF12），也稱白血病相關(guān)的Rho鳥苷交換因子（LARG），是在1例急性髓細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)的MLL基因的融合伙伴基因［1］。ARHGEF12特異性催化與Rho家族成員RhoA結(jié)合的GDP和GTP進(jìn)行交換，形成RhoA-GTP，從而激活RhoA并參與下游信號通路而發(fā)揮生物學(xué)功能［2］。Rho GTP酶也廣泛地參與正常造血過程，包括造血干/祖細(xì)胞的自我更新、歸巢及與骨髓微環(huán)境的相互作用

和各系血細(xì)胞的發(fā)育過程等；其異常表達(dá)和活化也與血液系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［3-6］。研究［7］顯示，抑制RhoA及其下游的ROCK信號通路可抑制K562細(xì)胞生長。但到目前為止，ARHGEF12對白血病細(xì)胞的作用尚不清楚。本研究旨在通過對不同髓系白血病細(xì)胞株的研究，了解ARHGEF12對白血病細(xì)胞生長的影響并探討其作用機(jī)制。

1　材料和方法

1.1主要試劑 人急性髓系白血病U937、KG1a、ML2、Kasumi-1、THP1細(xì)胞株，293T細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫或由其他實(shí)驗室贈予，由本實(shí)驗室傳代凍存。

RPMI 1640、DMEM、TRIzol購自美國Invitrogen公司；IMDM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自美國Life Technologies公司；ARHGEF12及ABL基因引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；qRT-PCR試劑盒購自大連Takara公司；ARHGEF12多克隆抗體、β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；Annexin V/7AAD-A細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Becton Dickinson公司；嘌呤霉素（puromysin，PM）購自美國Thermo Fisher公司；脫靶shRNA質(zhì)粒購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) U937、KG1a、ML2、Kasumi-1和THP1細(xì)胞用含10% FBS的IMDM培養(yǎng)液，293T細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.3RNA抽提 分別收集各細(xì)胞株［細(xì)胞計數(shù)為（5～10）×106/mL］的細(xì)胞，加入1 mL TRIzol，裂解后按說明書抽提RNA，置于-80 ℃保存。

1.4反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反應(yīng)體系如下：5×Prime-Script RT Master Mix 2 μL；總RNA 500 ng；DEPC水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，10 min。

1.5實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR） ARHGEF12前向引物序列：5’-AGCCGTCATGACAACAGTGC-3’；ARHGEF12反向引物序列：5’-CTAACCCACTCTGGCGCAAC-3’；所用儀器為ABI 7900H，反應(yīng)條件為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；40個循環(huán)。

1.6shRNA質(zhì)粒構(gòu)建 靶向ARHGEF12基因不同位點(diǎn)的3個pLKO.1-puro shRNA質(zhì)粒及脫靶shRNA質(zhì)粒（作為對照組）用黃色熒光蛋白Venus序列替換了嘌呤霉素抗性原件。

1.7病毒包裝和轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒DNA通過鈣轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入293T包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h收集病毒上清。白血病細(xì)胞與病毒上清在纖維連接蛋白（retronectin，RN）包被的24孔板中孵育36 h后，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8ARHGEF12蛋白表達(dá)的Western Blot測定 分別收集轉(zhuǎn)染3個shRNA后72 h的細(xì)胞及對照（NT）組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取蛋白質(zhì)，具體步驟參照文獻(xiàn)［8］。采用SDS-PAGE蛋白電泳進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，分別用ARHGEF12抗體（1：500）、β-actin抗體4 ℃過夜，TBST洗膜3次。二抗用含2%脫脂奶粉的TBST室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，然后顯影曝光。

1.9 流式細(xì)胞術(shù) 分別收集轉(zhuǎn)染shRNA后3 d及7 d的白血病細(xì)胞及NT組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，用流式細(xì)胞儀檢測黃色熒光蛋白Venus陽性的細(xì)胞比例，取敲低組與NT組的比值。收集轉(zhuǎn)染puroshRNA后48 h的白血病細(xì)胞并用嘌呤霉素（終濃度2.5 μg/mL）處理3 d，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，再用1×binding buffer緩沖液配制成1×106/mL的細(xì)胞懸液。各取100 μL加入Falcon試管中，先加入Annexin V染料5 μL，避光10 min。用PBS洗滌1次，再加入7AAD-A染料5 μL，避光15 min，上流式細(xì)胞儀測定結(jié)果。

1.10蛋白激酶芯片分析 收集轉(zhuǎn)染puro-shRNA后48 h的Kasumi-1細(xì)胞，并用嘌呤霉素（終濃度2.5 μg/mL）處理3 d，經(jīng)上海華盈生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行蛋白激酶芯片分析（送樣細(xì)胞數(shù)量1×107）。

2　結(jié)果

2.1ARHGEF12在不同髓系白血病細(xì)胞株中的表達(dá)通過RT-PCR檢測ARHGEF12在ML2、Kasumi-1、U937、THP1和KG1a細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果表明ARHGEF12

在Kasumi-1、U937和THP1細(xì)胞中表達(dá)量相對較高，而在KG1a細(xì)胞中表達(dá)量相對較低。見圖1。

圖1　ARHGEF12在不同髓系白血病細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2ARHGEF12基因敲低效果 在Kasumi-1細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染了3個shRNA，通過Western Blot檢測ARHGEF12蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示相較NT組有明顯敲低效果，其中shRNA1效果最顯著。見圖2。

圖2　ARHGEF12蛋白在shRNA敲低后的表達(dá)

2.3敲低ARHGEF12抑制白血病細(xì)胞生長 分別在KG1a（ARHGEF12低表達(dá)）和Kasumi-1（ARHGEF12高表達(dá)）細(xì)胞中敲低ARHGEF12，采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測敲低后3 h及7 h活細(xì)胞數(shù)量，在Kasumi-1細(xì)胞中活細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞生長被抑制。以上結(jié)果表明ARHGEF12在其高表達(dá)的細(xì)胞中對維持細(xì)胞生長是必需的。見圖3。

圖3　敲低ARHGEF12后對2種白血病細(xì)胞生長的影響

2.4敲低ARHGEF12增加白血病細(xì)胞的凋亡 分別在ARHGEF12高表達(dá)的Kasumi-1和U937細(xì)胞中敲低ARHGEF12，采用流式細(xì)胞術(shù)分析敲低后第3天的凋亡指標(biāo)Annexin V，在Kasumi-1細(xì)胞中3個shRNA都能明顯增加凋亡的細(xì)胞數(shù)，而在U937細(xì)胞中凋亡也有增加，但沒有Kasumi-1細(xì)胞明顯，Kasumi-1細(xì)胞用shRNA2敲低ARHGEF12后凋亡增加，見圖4-5。

圖4　敲低ARHGEF12后對2種白血病細(xì)胞凋亡的影響

2.5敲低ARHGEF12對下游信號通路的影響 在敲低ARHGEF12后第3天的Kasumi-1細(xì)胞中，從蛋白激酶芯片的結(jié)果顯示p53的第315位絲氨酸、CDK2第160位蘇氨酸及p27 Kip1第10位絲氨酸的磷酸化水平均較NT組上調(diào)。見表1。

圖5　Kasumi-1細(xì)胞用shRNA2敲低后的流式代表圖

表1　Kasumi-1細(xì)胞中敲低ARHGEF12后關(guān)鍵激酶磷酸化水平的變化

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)ARHGEF12能明顯降低白血病細(xì)胞中活細(xì)胞的比例，結(jié)合凋亡增加的表型，提示ARHGEF12在白血病細(xì)胞中主要通過調(diào)控凋亡途徑從而影響細(xì)胞的存活。蛋白激酶芯片的數(shù)據(jù)提示CDK2下游p53磷酸化上調(diào)，可能是對凋亡引起的DNA損傷的反應(yīng)［9-10］。

文獻(xiàn)［11-12］報道p27 Kip1可與cyclin E.CDK2復(fù)合物結(jié)合，從而控制細(xì)胞周期及細(xì)胞生長，而p27 Kip1第10位絲氨酸磷酸化可促使細(xì)胞周期阻滯在G1期。因此，敲低ARHGEF12后細(xì)胞生長抑制很可能與p27 Kip1第10位絲氨酸磷酸化上調(diào)引起的細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，本研究未進(jìn)行細(xì)胞周期相關(guān)檢測，尚待進(jìn)一步研究。

本研究選取的研究對象為白血病細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)ARHGEF12在不同髓系白血病細(xì)胞中的表達(dá)水平不盡相同，而在高表達(dá)的細(xì)胞中敲低該基因會導(dǎo)致細(xì)胞生長受抑制，這種抑制作用是敲低ARHGEF12后細(xì)胞凋亡增加及增殖抑制的共同結(jié)果，所以有必要在臨床樣本，尤其是急性髓系白血病病人樣本中檢測ARHGEF12的表達(dá)水平。對于ARHGEF12高表達(dá)的白血病患者，抑制ARHGEF12可作為一個潛在的治療靶點(diǎn)。

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（本文編輯：吳昔昔）

The role of Rho guanine nucleotide exchange factor 12 （ARHGEF12） in leukemia cell growth

GAO Li，XIE YangyangWANG XiangTANG YanjingTANG JingyanCHEN JingSHEN Shuhong.Department of Hematology and OncologyShanghai Children's Medical CenterSchool of MedicineShanghai Jiaotong University，Shanghai200127

ObjectiveTo assess the effect of ARHGEF12 on leukemia cell growth and the underlying mechanism.MethodsARHGEF12 expression was determined by quantitative RT-PCR in several leukemia cell lines.Knock-down of LARG was performed with shRNAs in leukemia cell lines and the flow cytometry analysis （FACS） was used to detect the growth and apoptosis of the leukemia cells after LARG silencing.Antibody assay screen of kinase phosphorylation was done to explore the potential mechanism.ResultsKnocking down ARHGEF12 in high expression cells would inhibit cell growthwhich resulted from increased apoptosis and decreased proliferation.Phosphorylation of p53CDK2 and p27 Kip1 were involved in this process.Conclusion：ARHGEF12 is essential for the growth of leukemia cellswith high expression of ARHGEF12downregulation of ARHGEF12 would cause increased cell apoptosis and inhibited cell proliferation as well.

ARHGEF12； leukemia cell； apoptosis

R733.7

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.006

2016-02-18

國家自然科學(xué)基金資助項目（81270623）。

高莉（1988-），女，江蘇蘇州人，住院醫(yī)師，碩士。

沈樹紅，主任醫(yī)師，Email：sshfranks@126.com。