槐耳聯(lián)合順鉑體外誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2自噬的實(shí)驗(yàn)研究

謝龍騰，邱國(guó)仕,蔣永生，翁家武，馬軍，柯婷婷

槐耳聯(lián)合順鉑體外誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2自噬的實(shí)驗(yàn)研究

謝龍騰，邱國(guó)仕,蔣永生，翁家武，馬軍，柯婷婷

目的觀察槐耳聯(lián)合順鉑是否能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬及探討其對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，分別用槐耳浸膏、順鉑及槐耳浸膏聯(lián)合順鉑干預(yù)HepG2細(xì)胞。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；光學(xué)顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞自噬的形態(tài)學(xué)改變；Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白P53、P-Akt、Akt表達(dá)的影響。結(jié)果光學(xué)顯微鏡下可觀察到藥物組細(xì)胞的形態(tài)改變；MTT實(shí)驗(yàn)顯示槐耳及順鉑均可抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈時(shí)間及濃度依賴性；各藥物組細(xì)胞P-Akt蛋白表達(dá)水平下降，Akt和P53表達(dá)升高。結(jié)論槐耳給藥可能是通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路激活肝癌HepG2自噬。

肝腫瘤；HepG2；癌細(xì)胞細(xì)胞自噬；槐耳；順鉑

原發(fā)性肝癌，特別是肝細(xì)胞性肝癌（以下簡(jiǎn)稱肝癌），是最常見的惡性腫瘤之一，絕大部分中晚期肝癌患者缺乏有效的治療措施；而且，對(duì)肝癌采取包括中藥在內(nèi)的綜合治療的療效明顯優(yōu)于單一化療藥物的治療。槐耳是我國(guó)重要的藥用抗腫瘤真菌．其主要成分是槐耳多糖蛋白（PS-T），臨床研究表明槐耳對(duì)肝癌有獨(dú)特的療效[1]，對(duì)其機(jī)制研究較多的是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。順鉑為臨床一線化療藥，因其單藥大劑量應(yīng)用可引起不可逆性腎功能損害及嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)，因此目前臨床主張聯(lián)合用藥[2]。自噬是指真核生物在一些應(yīng)激狀態(tài)下的一種細(xì)胞自我消化過(guò)程的一系列生化過(guò)程[3]。作為細(xì)胞程序性死亡的重要方式之一，越來(lái)越多的證據(jù)表明自噬在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和抗腫瘤藥物的療效上扮演著重要的角色[4]。本實(shí)驗(yàn)以肝癌細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，旨在通過(guò)槐耳聯(lián)合順鉑激活肝癌細(xì)胞 HepG2的自噬作用及其對(duì)相關(guān)蛋白P53、P-Akt、Akt表達(dá)的影響，探討其對(duì)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1材料槐耳顆粒（江蘇啟東蓋天力藥物有限公司）；小牛血清（美國(guó)Gibco公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，sigma公司）；RPMI-1640干粉（美國(guó) Gibco公司）；P-AKT（Abcam公司）；AKT antibody（Abcam公司），P53單克隆抗體（Abcam公司）；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG （Stanta Cruz公司）；-actin（Cell Signaling公司）。

1.2儀器CO2培養(yǎng)箱（HERAEUS）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；CKX41型倒置顯微鏡（OLYMPUS）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。細(xì)胞用含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；以0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化，按實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞密度接種，所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。

1.4MTT法測(cè)定

1.4.1不同濃度的槐耳及順鉑單獨(dú)作用對(duì)MGC803增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG2細(xì)胞消化后，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200l含有4×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，分別設(shè)槐耳組、順鉑組、空白對(duì)照組，每組6復(fù)孔。藥物組加不同濃度的槐耳使其終濃度分別為 2、 4、6、8 mg/ml；順鉑使其終濃度分別為10、20、30、40g/ml，空白對(duì)照組為不加藥物的培養(yǎng)基。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h和48h后棄上清液，期間在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，并攝影。之后用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，然后每孔加MTT 20 l，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，吸棄培養(yǎng)基，每孔加 150l DMSO，置微量振蕩儀上振蕩10 min，于酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定其OD值，以正常組OD值為對(duì)照，計(jì)算各孔細(xì)胞抑制率（%）=（1－各孔OD值/正常組OD值均數(shù)）×100%。

1.4.2槐耳與順鉑聯(lián)合給藥不同時(shí)間對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞消化后，制成4×103個(gè)/ml細(xì)胞混懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200l，正常培養(yǎng)24 h后，加入槐耳（4 mg/ml）+順鉑（10 g/ml）分別干預(yù)24 h。分別設(shè)空白對(duì)照組、聯(lián)合給藥組（4 mg/ml槐耳+10 g/ml順鉑）。其余實(shí)驗(yàn)步驟同步驟1.4.1。

1.5Western blot法檢測(cè) MMP-2蛋白的表達(dá)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，待其貼壁后，分為3組，分別為空白組，槐耳組（4 mg/ml）和聯(lián)合給藥組即槐耳（4mg/ml）+順鉑（10g/ml）。24 h后提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量后，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉2 h，加入一抗(1∶500），4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，滴加ECL液沖洗顯色檢測(cè)相應(yīng)蛋白條帶并拍照。同時(shí)以 -actin作為內(nèi)參照，比較確定P53，P-Akt和Akt的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞胞體飽滿，隨著槐耳濃度的增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)逐漸減少，部分細(xì)胞變圓，胞體變小，部分細(xì)胞破裂；大半細(xì)胞出現(xiàn)碎裂、脫落并漂浮于培養(yǎng)基中，呈壞死狀。見封三彩圖1。

2.2不同濃度槐耳、順鉑對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用槐耳、順鉑均可抑制HepG2細(xì)胞的增殖，且均呈時(shí)間、劑量依賴性，當(dāng)藥物干預(yù)48 h后，槐耳濃度達(dá)到8 mg/ml時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率僅為21.9%.；順鉑達(dá)到40.0g/ml，存活率為25.1%，對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制程度達(dá)到最大。 24 h、48 h槐耳組OD值與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≥3.41，均＜0.05）。見表1～2。

2.3槐耳與順鉑聯(lián)合干預(yù)不同時(shí)間對(duì)MGC803細(xì)胞存活率的影響槐耳+順鉑組 24 hMGC803細(xì)胞存活率為52.2%，48 h存活率為40.5%；24 h、48 h槐耳組、順鉑組、槐耳+順鉑組OD值與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≥3.43，均＜0.05）。見表3。

2.4槐耳對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響經(jīng)槐耳處理的HepG2細(xì)胞，P53和Akt蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，P-Akt表達(dá)低于正常組，且聯(lián)合順鉑給藥后這種差異更大，見圖1。

3　討論

自噬是真核細(xì)胞所共有的一種通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)過(guò)多或異常物質(zhì)以維持其正常功能的一種高度保守的生物學(xué)行為，能為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，緩解應(yīng)激壓力[5]。自噬作為細(xì)胞的一種適應(yīng)性應(yīng)答，對(duì)腫瘤具有雙重的作用。一方面，自噬可以通過(guò)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，抑制癌基因的激活，防止腫瘤的發(fā)生[6]。另一方面，自噬通過(guò)再循環(huán)作用，為癌細(xì)胞的生存提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而維持癌細(xì)胞的存活[7]?；倍且环N藥用真菌，槐耳菌質(zhì)的提取物，主要的抗癌活性成分為槐耳多糖，具有扶正與抗癌的雙重功能，多項(xiàng)基礎(chǔ)試驗(yàn)研究證明，該藥具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、提高機(jī)體免疫力等作用。目前已用于臨床，治療肝癌、乳腺癌、肺癌及胃癌等均有獨(dú)特的療效[8-11]，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K）家族成員屬于原癌基因，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等一系列的生理過(guò)程，Akt是一種分子量約為57 kD的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K信號(hào)通路的主要下游效應(yīng)分子之一。在許多惡性腫瘤中，PI3K/Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤形成及侵襲、腫瘤藥物療效等方面的調(diào)控[12]。如 -欖香烯作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞[13]和肺癌NSCLCA549細(xì)胞[14]均可通過(guò)抑制此通路而促進(jìn)相應(yīng)的細(xì)胞自噬。此外還有許多中藥成分均可激活細(xì)胞自噬通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路：槲皮素也對(duì)胃癌MNK28細(xì)胞[15]；白蘆藜醇對(duì)白血病TALL細(xì)胞[16]；麥冬皂苷B對(duì)肺癌H15/ H460細(xì)胞[17]等。

本研究發(fā)現(xiàn)，槐耳對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用。通過(guò)MTT結(jié)果可發(fā)現(xiàn)槐耳在體外聯(lián)合順鉑與單獨(dú)使用槐耳或順鉑相比對(duì) HepG2具有更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，顯微鏡下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果也證實(shí)槐耳聯(lián)合順鉑對(duì)細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，因而聯(lián)合用藥組顯示出了更明顯的優(yōu)勢(shì)。在 Western Blotting的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于空白實(shí)驗(yàn)組，單用槐耳組和槐耳聯(lián)合順鉑組均可上調(diào)P53、T-Akt蛋白的表達(dá)量，下調(diào)PAkt蛋白的表達(dá)量；槐耳聯(lián)合順鉑給藥可以通過(guò)上調(diào)P53、T-Akt及下調(diào)P-Akt促進(jìn)細(xì)胞自噬。說(shuō)明槐耳聯(lián)合給藥可能是通過(guò)抑制 PI3K/Akt信號(hào)通路激活肝癌HepG2自噬。

表1　不同濃度槐耳作用不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響（ =6）

表2　不同濃度順鉑作用不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響（ =6）

表3　槐耳與順鉑聯(lián)合干預(yù)不同時(shí)間對(duì)MGC803細(xì)胞存活率的影響（ =6）

圖1　Western blot法檢測(cè)組別處理肝癌HepG2細(xì)胞24h后P53P-Akt和Akt蛋白的表達(dá)情況

綜上所述，而槐耳作為一種新型抗腫瘤藥物，可以激活肝癌細(xì)胞自噬，其途徑可能是抑制 PI3K/Akt信號(hào)通路。兩者聯(lián)合使用可增加抗腫瘤活性，這也為臨床治療惡性腫瘤提供新的策略。

致謝我院作為溫州醫(yī)科大學(xué)非直管附屬醫(yī)院，非常感謝溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院的各位老師在本論文的完成過(guò)程中給予的各種幫助，使本實(shí)驗(yàn)可以在溫州醫(yī)科大學(xué)和浙江省生物技術(shù)工程制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開展實(shí)驗(yàn)。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.05.020

R735.7

A

1671-0800(2016)05-0601-03

2016-02-15

（本文編輯：姜曉慶）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計(jì)劃（2016KYB275），象山縣科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015C6005）

315700浙江省象山，象山縣第一人民醫(yī)院

蔣永生,Email: xsyykjk@126.com