UPLC-MS/MS法同時檢測人血漿中唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的方法研究Δ

魏　欣，安　靜，吳　茵，董占軍，范理菊，白萬軍（河北省人民醫院藥學部，石家莊　050051）

·臨床藥學與研究·

UPLC-MS/MS法同時檢測人血漿中唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的方法研究Δ

魏欣＊，安靜，吳茵，董占軍#，范理菊，白萬軍（河北省人民醫院藥學部，石家莊050051）

目的：建立快速、準確、可同時檢測人血漿中唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的分析方法。方法：血漿樣品經液-液萃取后，以卡馬西平為內標，采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測。色譜柱為WatersACQUITY UPLC HSS T3，流動相為0.1%氨水-乙腈（梯度洗脫），流速為0.2 ml/min，柱溫為40℃，進樣量為5 μl。采用電噴霧離子源，以多反應監測方式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 308.2→263.1（唑吡坦）、m/z 389.3→245.0（右佐匹克?。/z 306.2→236.1（扎來普?。?、m/z 237.3→151.2（內標）。結果：唑吡坦、右佐匹克隆、扎來普隆血藥濃度分別在0.02～20.00、0.50～20.00、0.02～20.00 ng/ml范圍內線性關系良好（r分別為0.990 1、0.996 8、0.991 7），定量下限分別0.02、0.50、0.02 ng/ml，檢測限分別為0.01、0.20、0.01 ng/ml；日內、日間RSD＜15%，提取回收率為88.9%～106.5%，基質效應為94.8%～106.3%。結論：該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好，可用于人血漿中唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的同時檢測。

超高效液相色譜-串聯質譜法；唑吡坦；右佐匹克?。辉鷣砥章。粰z測

1　材料

1.1儀器

LC-30AD型超高效液相色譜系統（日本島津公司）；AB Sciex Triple Quad 5500型三重四級桿串聯質譜儀（美國AB公司）；Zentrifuge 1602型高速低溫離心機（德國Hettich公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB204-S標準型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海精科實業有限公司）。

1.2藥品與試劑

唑吡坦對照品（批號：171258-200601，純度：99.0%）、右佐匹克隆對照品（批號：100871-200801，純度：100.0%）、扎來普隆對照品（批號：100670-200401，純度：98.5%）、卡馬西平對照品（內標，批號：100142-201105，純度：99.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、甲酸、甲酸銨均為色譜純，氫氧化鈉為分析純，水為純凈水?？瞻籽獫{來源于我院體檢中心。

2　方法與結果

2.1色譜與質譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：0.1%氨水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1.00 min，70%A；＞1.00～6.00 min，70%A→10%A；＞6.00～7.00 min，10%A；＞7.00～7.01 min，10%A→70%A；＞7.01～10.00 min，70%A）；流速：0.2 ml/min；柱溫：40℃；進樣量：5 μl。

采用電噴霧離子源（ESI），以多反應監測（MRM）模式掃描，正離子方式檢測。電噴霧電壓（IS）：5 500V；離子源溫度（TEM）：650℃；氣簾氣（CUR）壓力：35 psi；碰撞氣（CAD）壓力：8 kPa；輔助氣1（GS1）壓力：65 psi；輔助氣2（GS2）壓力：65 psi；射入電壓（EP）：10 V；射出電壓（CXP）：14 V；其余質譜參數見表1。

表1　質譜參數Tab 1　Parameters of mass spectrometry

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液精密稱取各對照品適量，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得唑吡坦、右佐匹克隆、扎利普隆質量濃度約為1 mg/ml的對照品貯備液，置－20℃冰箱中保存。精密吸取各對照品貯備液適量，置于同一量瓶中，用甲醇配制成質量濃度為1 mg/ml的混合對照品貯備液，并逐級稀釋成質量濃度為200、100、50、10、5、2、1、0.5、0.2 ng/ml的系列混合對照品溶液。

2.2.2內標溶液精密稱取內標對照品適量，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為1 mg/ml的內標貯備液，置－20℃冰箱中保存。精密吸取內標貯備液適量，置于100 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成質量濃度為10 μg/ml的內標溶液，備用。

2.3血漿樣品處理

取血漿0.1 ml，置于1.5 ml塑料離心管中，加入內標溶液10 μl，渦旋混勻15 s，加入0.01 mol/L氫氧化鈉溶液10 μl，渦旋混勻15 s，加入萃取溶液[二氯甲烷-正己烷-乙酸乙酯（5∶4∶1，V/V/V）]400 μl，渦旋混勻1 min，以離心半徑5 cm、轉速14 000 r/min高速離心5 min，取上清液，用氮氣吹干，殘渣用80%乙腈復溶，取5 μl進樣分析。

2.4方法學考察

2.4.1專屬性考察通過比較空白血漿與含藥血漿樣品，考察內源物質是否會對檢測造成影響。結果顯示，在“2.1”項色譜與質譜條件下，內源性物質無明顯干擾，唑吡坦、右佐匹克隆、扎來普隆與內標峰形良好，保留時間分別為5.75、5.25、5.35 min。其典型色譜圖見圖1。

2.4.2標準曲線制備和定量下限考察取空白血漿及相應質量濃度的混合對照品溶液各適量，分別配制成相當于唑吡坦質量濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 ng/ml，右佐匹克隆質量濃度為0.50、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 ng/ml，扎來普隆質量濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、 0.50、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 ng/ml的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣測定，記錄色譜圖。以待測物質量濃度（x）為橫坐標、待測物與內標峰面積的比值（y）為縱坐標，用加權最小二乘法（加權系數w=1/x2）進行線性回歸，得回歸方程分別為——唑吡坦：y唑=1.650 0x唑+0.014 1（r=0.990 1，n= 3）；右佐匹克?。簓右=0.020 8x右－0.000 4（r=0.996 8，n=3）；扎來普?。簓扎=0.400 0x扎+0.003 4（r=0.991 7，n=3）。結果表明，唑吡坦、右佐匹克隆、扎來普隆血藥濃度分別在0.02～20.00、0.50～20.00、0.02～20.00 ng/ml范圍內線性關系良好，r＞0.990；其定量下限分別為0.02、0.50、0.02 ng/ml，檢測限分別為0.01、0.20、0.01 ng/ml。

圖1　典型色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+待測物+內標；1.唑吡坦；2.右佐匹克??；3.扎來普?。?.內標Fig 1　Typical chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+analyte+internal standard；1.zolpidem；2.eszopiclone；3.zaleplon；4.internal standard

2.4.3精密度與準確度試驗分別配制唑吡坦低、中、高質量濃度（0.05、0.50、16.00 ng/ml，下同）的血漿樣品，右佐匹克隆低、中、高質量濃度（0.50、5.00、16.00 ng/ml，下同）的血漿樣品，扎來普隆低、中、高質量濃度（0.05、0.50、16.00 ng/ml，下同）的血漿樣品各5份，連續測定3 d，根據當日標準曲線計算各待測物的實測質量濃度，考察各質量濃度下的精密度與準確度。結果顯示，三者日內、日間RSD＜15%，回收率為88.6%～112.2%，表明方法的精密度、準確度良好。精密度與準確度試驗結果見表2。

2.4.4提取回收率和基質效應試驗分別配制唑吡坦、右佐匹克隆、扎來普隆低、中、高質量濃度的血漿樣品，每質量濃度取5樣本分析，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄相應峰面積（C）。取空白血漿適量，按“2.3”項下方法處理后加入適量相應質量濃度的對照品溶液，使最終質量濃度與前者相對應，每質量濃度取5樣本分析，記錄相應峰面積（B）。取相應質量濃度的對照品溶液適量，不經處理，直接進樣分析，記錄相應峰面積（A）。按公式：提取回收率（%）=C/B×100%、基質效應（%）=B/A×100%計算。結果顯示，唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的提取回收率為88.9%～106.5%，內標的提取回收率為90.3%；基質效應為94.8%～106.3%，內標的基質效應為104.3%，符合生物樣品檢測要求[4]。提取回收率和基質效應試驗結果見表3。

表2　精密度與準確度試驗結果（±s）Tab 2　Results of precision and accuracy tests（±s）

表2　精密度與準確度試驗結果（±s）Tab 2　Results of precision and accuracy tests（±s）

?

表3　提取回收率和基質效應試驗結果（n=5）Tab 3　Results of extraction recovery and matrix effect tests （n=5）

2.4.5穩定性試驗配制唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆低、高質量濃度的血漿樣品，分別考察在室溫下放置24 h和經歷3次凍融循環（－20℃～20℃）后的穩定性。結果顯示，各樣品的RSD＜15%，表明各待測物在上述條件下穩定。穩定性試驗結果見表4。

表4　穩定性試驗結果（±s， n=3）Tab 4　Results of stability tests（±s， n=3）

表4　穩定性試驗結果（±s， n=3）Tab 4　Results of stability tests（±s， n=3）

待測物唑吡坦右佐匹克隆扎來普隆理論質量濃度，ng/ml 0.05 16.00 0.50 16.00 0.05 16.00室溫放置24 h實測質量濃度，ng/ml 0.048±0.006 15.756±1.789 0.484±0.037 15.928±1.327 0.048±0.005 15.918±1.121 RSD，% 11.68 11.35 07.69 08.33 10.29 07.04經歷3次凍融循環實測質量濃度，ng/ml 0.052±0.049 15.962±1.198 0.503±0.022 15.141±1.255 0.047±0.004 15.380±1.475 RSD，% 5.84 7.51 4.29 8.32 8.93 9.59

3　討論

3.1檢測方法比較

目前，國內外主要采用氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、氣質聯用法[7]、液質聯用法[8-9]等對NBZD血藥濃度進行檢測。這些方法或多或少存在靈敏度低、樣品處理過程復雜、分析時間長等問題。有文獻報道，采用熒光色譜法（HPLC-FLU法）測定人血漿中唑吡坦的濃度，靈敏度雖有很大提高，但操作過程繁雜，系統誤差大，而且進樣體積大，色譜柱耐受性差[10-12]。吳海等[13]采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法同時測定了家兔全血中佐匹克隆、唑吡坦和扎來普隆的濃度，但其分析時間長，檢測限為1～3 ng/ml。

UPLC-MS/MS法集液相色譜的高分離能力和質譜的高靈敏度、強結構定性等特征于一體，具有專屬性強、快速、靈敏、準確、可靠等優點，是化學成分定性定量分析的有力工具。本研究采用UPLC-MS/MS法快速、準確地檢測人血漿唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的濃度，可應用于臨床和法醫毒物相關物質的檢測、鑒定[14]，為急診科和法醫鑒定此類藥物中毒提供了技術支持，同時也為治療藥物監測及臨床合理用藥提供了參考依據。

3.2液-液萃取條件的選擇

前期試驗比較了不同萃取時間（0.5、1、2、3、4、5 min）對3種待測物提取回收率的影響，結果表明，各萃取時間下提取回收率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。為保證萃取效率，最終將萃取時間確定為1 min。前期試驗還比較了0、0.01、0.02、0.05、0.10 mol/L氫氧化鈉溶液對萃取的影響，結果表明，當氫氧化鈉濃度為0.01 mol/L時，3種待測物均有較高的萃取率，提示低濃度的堿性萃取液有利于該類物質的萃取，故最終將氫氧化鈉的濃度確定為0.01 mol/L。此外，試驗還考察了不同體積（100、200、400、600 μl）萃取溶劑（二氯甲烷-正己烷-乙酸乙酯）對萃取效率的影響，結果顯示，隨著萃取溶劑體積的增加，各待測物提取回收率也隨之增大，故最終將萃取溶劑的體積確定為400 μl。

綜上，本試驗建立了同時檢測人血漿中唑吡坦、扎來普隆和右佐匹克隆的UPLC-MS/MS法，該方法具有操作簡便、靈敏度高、檢測快速等特點，可用于人血漿中NBZD的同時檢測。

[1]陸維君.抗失眠藥物的臨床應用[J].中國現代藥物應用，2010，4（6）：235.

[2]Meatheall RC.Zopiclone fatality in a hospitalized patient [J].J Forensic Sci，1997，42（2）：340.

[3]孟瑞，盧敏.佐匹克隆中毒32例的救治體會[J].泰山醫學院學報，2010，31（11）：874.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：363-368.

[5]Debruyne D，Lacotte J，Hurault de Ligny B，et al.Determination of zolpidem and zopiclone in serum by capillary column gas chromatography[J].J Pharm Sci，1991，80 （1）：71.

[6]楊麗君，Rochholz G.反相高效液相色譜法測定血清中的佐匹克隆[J].色譜，2002，20（3）：256.

[7]王占良，張建麗，張亦農.氣相色譜-質譜聯用法檢測保健品中8種安眠鎮靜類藥物[J].質譜學報，2009，30（5）：282.

[8] 劉蒼松，于忠山，董穎.LC-MS/MS法測定人血中唑吡坦成分[J].刑事技術，2008，33（3）：9.

[9]張蕾萍，周紅，董穎，等.血液和尿液中右旋佐匹克隆鑒定1例[J].中國法醫學雜志，2012，27（5）：410.

[10]宋洪杰，李珍，石晶，等.酒石酸唑吡坦的藥動學和生物利用度研究[J].中國臨床藥理學雜志，2000，16（2）：122.

[11]宋洪杰，李珍，石晶，等.高效液相色譜-熒光檢測法測定人血漿唑吡坦的濃度[J].中國藥學雜志，2001，36（5）：333.

[12] 苗彩云，陳江飛，朱素燕，等.HPLC-熒光法測定大鼠微量血漿中酒石酸唑吡坦的含量[J].中國藥房，2016，27 （4）：468.

[13]吳海，晏曉軍，高汩，等.LC-MS/MS同時檢測全血中佐匹克隆、唑吡坦和扎來普隆[J].刑事技術，2013，38（2）：22.

[14]張蕾萍，黃霜，舒翠霞，等.UPLC-MS/MS檢驗尿液中的扎來普隆和5-氧-扎來普隆[J].刑事技術，2015，40（2）：122.

（編輯：張元媛）

Study on Simultaneous Determination Method of Zolpidem，Dexzopiclone and Zaleplon in Human Plasma by

UPLC-MS/MS
WEI Xin，AN Jing，WU Yin，DONG Zhanjun，FAN Liju，BAI Wanjun（Dept.of Pharmacy，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China）

OBJECTIVE：To develop a method for rapid，accurate and simultaneous determination of dexzopiclone，zolpidam and zaleplon in human plasma.METHODS：After the plasma sample was processed by liquid-liquid extraction，UPLC-MS/MS was established to detect plasma sample with carbamazepine as internal standard.The separation was performed on a Waters ACQUITY UPLC HSS T3column with mobile phase composed of 0.1%ammonium solution-acetonitrile（gradient elution）at flow rate of 0.2 ml/min.The column temperature was set at 40℃，and sample size was 5 μl.The detection was performed by multiple reaction monitoring（MRM）via electrospray ionization（ESI）source in positive mode.The mass transition ion-pairs were as follows：m/z 308.2→263.1（zolpidem），m/z 389.3→245.0（dexzopiclone），m/z 306.2→236.1（zaleplon），m/z 237.3→151.2（internal standard）.RESULTS：The linear range of zolpidem，dexzopiclone and zaleplon were 0.02-20.00，0.50-20.00，0.02-20.00 ng/ml，respectively （r=0.990 1，0.996 8，0.991 7）.LLOQ of them were 0.02，0.50，0.02 ng/ml，and detection limit were 0.01，0.20，0.01 ng/ml.RSDs of intra-day and inter-day were all lower than 15%；extraction recovery were 88.9%-106.5%；matrix effect were 94.8%-106.3%.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，sensitive and specific，and it can be used for simultaneous determination of zaleplon，zolpidem and dexzopiclone in human plasma.

UPLC-MS/MS；Zolpidem；Dexzopiclone；Zaleplon；Determination

R917文獻標志碼A

1001-0408（2016）23-3194-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.23.09

河北省科技計劃項目（No.14273002D）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：醫院藥學。電話：0311-85988004。E-mail：13933171365@163.com

主任藥師，博士。研究方向：臨床藥學、藥理學。電話：0311-85988604。E-mail：13313213656@126.com

2016-01-17

2016-05-13）