晚期肝癌免疫微環境CD38表達水平與PD-1抑制劑療效相關性分析

孫小虎 王璐 白靜慧 于洪

肝細胞癌(hepatic cellular cancer, HCC)是第三大癌癥相關死亡原因，僅次于肺癌和胃癌[1,2]。目前多采用手術切除和肝移植的方法治療早期HCC，但早期手術切除的5年生存率仍較低，且術后的復發率高達70%[3]。

目前，多激酶靶向抑制劑索拉非尼及樂伐替尼被用于晚期HCC的一線治療，主要通過抑制血管內皮生長因子發揮作用[4]。隨著研究的進展，免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors, ICI)逐步被應用到晚期HCC的治療中，如PD-1抑制劑納武尤利單抗(nivolumab)等，但當前的臨床試驗顯示僅有約20%的患者對治療有反應[5]。研究表明，晚期HCC患者中CD38+免疫細胞的表達與預后有關[6]。本研究探索晚期HCC中CD38分子的表達水平與PD-1抑制劑治療效果的相關性。

資料與方法

一、一般資料

選取2019年1月1日至2020年12月31日遼寧省腫瘤醫院接受免疫治療(PD-1抑制劑)晚期肝癌患者60例，其中男性43例，女性17例。納入標準：①年齡18～70歲；②肝癌臨床分期為III及IV期，已無手術指征；③既往未接受過免疫治療(PD-1/PD-L1/CTLA-4抑制劑)；④無肝穿刺禁忌；⑤一般情況尚可，ECOG評分為0～1分，肝功能Child-Pugh為A或B級，預期壽命≥3個月；⑥治療前臨床資料完整。排除標準：①合并嚴重肝、腎損傷或自身免疫性疾病；②對本研究使用藥物過敏的患者；③合并其他惡性腫瘤的患者；④門靜脈主干或腔靜脈存在癌栓的患者。所有患者簽署相關知情同意書。本研究獲得醫院倫理委員會的批準。

二、生物信息學數據

從KM-plotter數據庫(http://kmplot.com/analysis/index.php?P=service)中搜索CD38在HCC中的信息，繪制相對于正常組織而言，CD38在HCC及晚期HCC中的生存分析曲線。

收集患者性別、年齡、甲胎蛋白(AFP)水平、當前PD-1抑制劑為幾線治療方案、是否為乙肝或丙肝患者、Child-Pugh分級、BCLC分期、ECOG評分、是否存在血管侵犯、既往是否行外科手術或介入治療及影像學資料等。

所有患者在使用PD-1抑制劑前均進行血液檢查包括血清膽紅素、血漿白蛋白、凝血功能等，影像學檢查包括原發腫瘤灶、腹水、轉移情況。

三、肝穿刺活檢

采用MyLab Twice(意大利)及Resona7型超聲診斷儀進行超聲定位下穿刺，檢查前空腹8 h以上。患者取左側臥位，常規消毒右側腋前線9～10肋間隙，利多卡因局部麻醉，在超聲引導下進針至肝包膜下1 cm處，使用一次性自動活檢針迅速取肝組織1～2 cm，固定。每例患者多點取材(3-5次)。取同期手術切除HCC患者的癌旁組織10份作為對照。

四、 免疫組織化學檢查

采用SP系列試劑盒進行免疫組織化學染色，石蠟切片脫蠟至水—蒸餾水沖洗—PBS浸泡5 min—抗原修復25 min—3%H2O2室溫孵育—PBS沖洗—加入5%～10%山羊血清孵育10 min后加入一抗(鼠抗人CD38單克隆抗體，購自Santa Cruze公司，稀釋為1∶100)4℃低溫過夜—PBS沖洗—二抗37℃孵育10～20 min—PBS沖洗—添加標記好的鏈霉卵白素孵育10～30 min—PBS沖洗—DAB顯色—蘇木精復染。結果判讀：將所有的染色切片在光鏡下觀察并進行圖像采集。CD38表達于HCC癌巢中部分腫瘤細胞、間質細胞及細胞外基質。高倍鏡下選取5個視野進行拍照記錄。視野內未見淺黃色及棕黃色部分為CD38陰性(-)，視野內淺黃色陽性率在10%～30%為CD38弱陽性(+)，視野內淺黃色部分超過30%或棕黃色部分超過10%為CD38表達強陽性(++)，CD38(-)及CD38(+)為低表達，CD38(++)為高表達。

五、 PD-1抑制劑治療

患者使用的PD-1抑制劑的種類不同，其中特瑞普利單抗12例，卡瑞麗珠單抗17例，信迪利單抗31例。特瑞普利單抗為每3周1次，每次240 mg，靜脈滴注；卡瑞利珠單和信迪利單抗為每3周1次，每次200 mg，靜脈滴注。

六、觀察指標

主要觀察指標為無進展生存期(progression-free survival, PFS)，次要觀察指標為總生存期(overall Survival, OS)。治療效果的評估采用mRECIST標準，完全緩解(complete response, CR)：患者所有目標病灶腹部CT示動脈期增強顯影(目標病灶)均消失；部分緩解(partial response, PR)：腹部CT示目標病灶直徑總和縮小≥30%；疾病穩定(stable disease, SD)：目標病灶縮小未達到PR或增大未達到PD；疾病進展(progressive disease, PD)：目標病灶的直徑總和增大≥20%或出現新的病灶。患者每次入院接受治療前均行腹部增強CT檢查以評估疾病情況，記錄6個療程后的治療效果。治療有效=CR+PR+SD。治療結束后隨訪時間至2021年10月1日。

七、 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。計數資料以例數表示，比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman檢驗，單因素分析采用Kaplan-Meier法，并繪制生存分析曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、CD38在肝癌組織中的表達

在KM-plotter數據庫中，所有肝癌患者及晚期肝癌患者的CD38低表達均預示PFS更短(P<0.05)，如圖1A和1B所示。本研究60例晚期肝癌患者肝癌組織中，CD38(-)21例，CD38(+)17例，CD38(++)22例；手術切除的HCC患者10份癌旁組織樣本中CD38表達陰性0例，CD38(+)1例，CD38(++)9例；差異有統計學意義(χ2=10.126，P=0.006)。

二、CD38表達與PD-1抑制劑治療效果的相關性

60例患者中，CD38低表達38例，高表達22例。6個治療周期后，達到CR患者0例，PR患者6例[CD38(+)1例，CD38(++)5例]，SD患者15例[CD38(-)3例，CD38(+)5例，CD38(++)7例]，PD患者39例[CD38(-)20例，CD38(+)9例，CD38(++)10例]，治療有效21例，無效39例。治療有效患者中CD38低表達9例、高表達12例；治療無效患者中CD38低表達29例，高表達10例，差異有統計學意義(χ2=5.833，P=0.016)。Spearman檢測CD38表達與PD-1抑制劑治療效果之間存在明顯相關性(r=-0.404，P<0.05)。

三、 CD38表達與患者生存的關系

至隨訪期結束，60例患者中共有47例(78.33%)患者死亡，有8例(13.33%)患者出現疾病進展，5例(8.33%)患者疾病未進展，CD38高表達及低表達組的PFS及OS如圖2A、B所示。

A：KM-plotter數據庫中CD38在晚期HCC中的PFS生存曲線(n=88)；B：KM-plotter數據庫中CD38在總HCC樣本中的PFS生存曲線(n=366)；C癌旁正常組織CD38的表達情況；D：晚期HCC患者肝組織CD38的表達情況

A：CD38高表達患者與低表達患者OS曲線；B：CD38高表達與低表達患者PFS曲線

四、 影響晚期肝癌患者PFS的相關因素分析

單因素分析顯示BCLC分期、Child-Pugh分級及CD38的表達可能與患者的PFS相關(P<0.05)，見表1所示。

表1 影響患者PFS的相關因素分析

討 論

不同于細胞毒性治療、小分子靶向抑制劑等治療方式，免疫治療可直接靶向腫瘤本身和腫瘤免疫微環境，是一種具有前景的新型治療方法。PD-1/PD-L1/CTLA-4抑制劑在某些癌癥的反應率相對較低，限制了其臨床使用。可能與患者的腫瘤免疫微環境存在著明顯差異有關。

機體正常T細胞上CD38的表達與其激活狀態有關[7]。其在不同類型的腫瘤中表達不一，可通過促進能量代謝的方式促進鼻咽癌的進展[8]，也可以通過抑制腫瘤的能量代謝而抑制前列腺癌的進展[9]。在HCC中，CD38表達的增加與M1巨噬細胞的激活相關，這一過程的特點是CD80表達增加，IL-6及TNF-α的分泌增加，這些細胞因子有助于提高抗腫瘤免疫[10]。使CD38可作為HCC免疫治療的一個潛在的靶點。

本研究結果顯示，CD38發揮抑制HCC進展的作用，CD38高表達的患者具有更長的PFS。通過對比PD-1抑制劑治療患者的CD38的表達水平，顯示出CD38的水平與PD-1抑制劑治療效果的相關性。對骨髓移植后的患者外周血淋巴細胞亞群分析顯示，移植者外周血出現明顯增多的CD38+T細胞，CD38+CD4+T細胞發揮出較高的細胞溶解及產生干擾素-γ的潛能，具有一定的免疫器官損傷的作用[11]。在HCC中，CD38與巨噬細胞特異性標志物CD68共同表達，CD38+CD68+巨噬細胞的密度與HCC患者術后的良好預后相關[10]。

PD-L1表達的增加通常與PD-1抑制治療的臨床療效較好相關，但并非適用于所有腫瘤[12-14]。其中一個可能的機制是細胞外的腺苷通過腫瘤固有免疫的作用而發揮免疫抑制效應。CD38在一部分治療所誘導的免疫細胞亞群中具有較高的表達[15]，被認為是一類具有潛力的分子。有研究認為，PD-1/PD-L1抑制劑會因高表達的CD38而出現耐藥，在腫瘤免疫微環境中全反式維甲酸和IFN-β釋放之后出現，是通過腺苷途徑抑制CD8+T細胞的效應，而本研究中發現高表達的CD38與HCC患者的預后相關，這表明CD38與PD-1/PD-L1之間的生物學聯系仍有待探索。

本研究通過對晚期HCC患者的臨床資料及腫瘤組織進行分析，表明高表達的CD38預示著HCC患者的良好預后。但本研究樣本數量少，隨訪時間短，有待后續研究的進一步開展。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。