響應面法優化蜂膠總黃酮的提取工藝

安硯波　王　浩（1山東醫藥技師學院，泰安271016；2泰山醫學院藥學院，泰安271016）

響應面法優化蜂膠總黃酮的提取工藝

安硯波王浩
（1山東醫藥技師學院，泰安271016；2泰山醫學院藥學院，泰安271016）

優化蜂膠總黃酮的提取工藝。方法：以蜂膠總黃酮提取得率為指標，通過響應面分析法優化蜂膠黃酮的提取工藝，并對最佳提取工藝進行驗證。結果：蜂膠總黃酮提取的最佳工藝參數為：乙醇濃度72.48%，超聲功率82.44%，超聲時間25.11min，總黃酮的得率達到13.07%。結論響應面分析法可以很好地對蜂膠總黃酮提取工藝進行優化，對實際生產具有理論指導意義。

蜂膠；黃酮；響應面法

蜂膠（Propolis）是一種天然的活性物質，是蜜蜂從植物芽孢或樹干采集的蜂蜜，混入蜜蜂上頜腺分泌物和蜂蠟后加工制成的芳香味的膠狀固體物質［1］。蜂膠中含有豐富的黃酮類物質，如蕓香苷、槲皮素、高良姜素、楊梅素、松屬素、山奈酚、芹菜素等，約占總黃酮的20～30%［2］。蜂膠黃酮具有多種生物學活性，如抗炎、抗過敏、抗癌、抗病毒、抗增生、抗細胞分化、抗氧化清除氧自由基等，因此蜂膠成為一種具有很大開發潛力的天然中藥材和天然保健食品［3-5］。

響應面法（Response Surface Method，RSM）是通過對響應曲面及等高線的分析尋求最優工藝參數，采用多元二次回歸方程來擬合響應值與因素之間函數關系的一種優化統計方法［6-7］，其優點是在試驗條件優化過程中可以連續地對試驗因素的各個水平進行分析，所以廣泛應用于試驗設計與工藝優化研究［8-10］。本實驗利用超聲法提取蜂膠黃酮，并利用響應面法對其提取工藝進行了優化，以確定其較優的提取工藝條件。

1.材料

蜂膠原膠，由山東省實驗種蜂場提供；蘆丁標準品，購自中國藥品生物制品檢定所；三氯化鋁；無水乙醇等均為國產分析純；KQ-600DB型數控超聲波清洗器（可控溫），昆山市超聲儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計，島津制作所。

2.方法

2.1標準溶液的配制和標準曲線的制備

參照文獻［11-12］，準確稱取蘆丁標準品0.0050g，用70%的乙醇溶液溶解并定容至25ml搖勻，取2.5ml該溶液用70%的乙醇定容至25ml，得質量濃度為0.0200mg/ml的蘆丁標準液。分別取上述蘆丁標準液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10 ml容量瓶中，加入70%乙醇稀釋至5.0 ml。滴加10%AlCl3溶液0.1 ml，搖勻，用蒸餾水稀釋至刻度，顯色15 min，以空白試劑為參比液，于波長422 nm處測其吸光度。以吸光度為縱坐標，蘆丁標準液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得標準曲線方程為y=29.7x-0.0044（R2=0.9992）。

2.2蜂膠總黃酮含量的測定

以蘆丁為參照測定蜂膠總黃酮含量。準確稱取蜂膠總黃酮提取物0.5g于25ml容量瓶中，按一定的液固比（V/m）加入乙醇水溶液，超聲一定時間，離心。上清液用70%乙醇水溶液定容，搖勻，準確吸取0.1ml置于試管中，在試管中加入0.1ml三氯化鋁搖勻，在紫外分光光度計中測得吸光度，帶入蘆丁標準曲線方程中，計算可得蜂膠總黃酮的含量，即為得率。

3.結果和討論

3.1方法學考察

3.1.1重現性實驗 取2.2方法提取的樣品重復測定5次，求得相對標準偏差（RSD）為1.02%。

3.1.2穩定性試驗將2.2提取的樣品每隔5min測定一次吸光度，求得RSD=0.26%，

3.1.3回收率試驗精密稱取5份蜂膠，分別加入蘆丁標準品0.05mg按3.2所述制得樣品液，測得加標平均回收率為112.6%，RSD為1.06%。

3.2單因素試驗

3.2.1乙醇濃度對總黃酮得率的影響

圖1為液固比20∶1、超聲30min、功率70%、30℃的條件下，不同乙醇濃度對蜂膠總黃酮得率的影響。由圖1可知，隨著乙醇濃度的提高，蜂膠總黃酮得率呈上升趨勢，當乙醇濃度達到70%時總黃酮得率最大，之后隨著濃度的增加，得率反而降低。

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圖1　乙醇濃度對總黃酮得率的影響

3.2.2超聲時間對總黃酮得率的影響

圖2為乙醇濃度70%、液固比20：1、功率70%、30℃的條件下，不同超聲時間對總黃酮得率的影響。由圖2可知，超聲20～40min內總黃酮得率呈上升趨勢，然后隨時間的延長有所下降。因此，本實驗選擇超聲時間為30min。

圖2　超聲時間對總黃酮得率的影響

3.2.3液固比對總黃酮得率的影響

圖3為乙醇濃度70%、超聲30min、功率70%、溫度30℃的條件下，不同液固比對總黃酮得率的影響。由圖3可知，蜂膠總黃酮得率隨著溶劑量的增加而增加，在液固比達到15∶1后，總黃酮得率有所降低，由此確定蜂膠黃酮提取的液固比以15：1為宜。

圖3　液固比對總黃酮得率的影響

3.2.4溫度對總黃酮得率的影響

圖4為乙醇濃度70%、超聲30min、功率70%、液固比15∶1的條件下，不同溫度對總黃酮得率的影響。由圖4可知，蜂膠總黃酮得率隨著溫度的增加而增加，在溫度達到60℃后，總黃酮得率有所降低，因此，本實驗選擇蜂膠黃酮提取溫度為60℃。

圖4　溫度對總黃酮得率的影響

圖5　功率對總黃酮得率的影響

3.2.5超生功率對總黃酮得率的影響

圖5為乙醇濃度70%、超聲30min、液固比15：1、溫度60℃的條件下，不同功率對總黃酮得率的影響。由圖5可知，蜂膠總黃酮得率隨著功率的增大而增加，在功率達到70%后，總黃酮得率反而降低，由此確定蜂膠黃酮提取的功率宜設為70%。

3.3關鍵影響因素確定

3.4響應面法對蜂膠黃酮提取工藝優化

表1　Box-Behnken試驗設計及相應值

3.4.1Box-Behnken設計方案及結果

由Box-Behnken設計方案所得的試驗結果見表1。

經回歸擬合后，得到以蜂膠總黃酮得率為響應值的回歸方程為：Y=0.031+（8.750E-004）*X1+（6.250E-004）*X2+（-2.500E-004）*X3+（1.750E-003）*X1X2+（-5.000E-004）*X1X3+（-5.575E-003）*X12+（-1.075E-003）*X22+（1.175E-003）*X32

從表2的方差分析結果看，乙醇濃度的“Prob＞F”值大于0.05，表明其對總黃酮得率的影響不顯著，超聲功率的“Prob＞F”值大于0.05，表明其對總黃酮得率的影響不顯著，超聲時間的“Prob＞F”值大于0.05，表明其影響不顯著。整體模型的“Prob＞F”值小于0.01，表明該二次方程模型高度顯著；失擬項比F值為1.22，表明失擬項相對于絕對誤差是不顯著的，而不顯著的失擬項才可取；決定系數為0.9430，表明其應變量與全體自變量之間的多元回歸關系顯著，即說明該回歸方程對試驗擬合情況較好，試驗誤差小，因此可用該回歸方程對不同提取條件下的蜂膠總黃酮得率進行預測。

圖6　乙醇濃度和功率對總黃酮得率的影響

圖7　超聲時間和功率對總黃酮得率的影響

表2　回歸方程方差分析

響應面圖形是響應值對各因素（X1、X2、X3）所構成的三維空間的曲面圖，從圖6、7上可形象的看出各因素交互作用對響應值的影響。比較圖6、7可知，乙醇濃度對蜂膠總黃酮得率的影響最為顯著，表現為曲線較陡，乙醇濃度最佳值在72%左右；而超聲功率和超聲時間次之，表現為曲線較為平滑，其最佳響應值分別在82%和25min左右。

3.4.2蜂膠總黃酮提取工藝條件的確定及驗證

通過回歸模型預測的蜂膠總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度72.48%，提取功率82.44%，超聲時間25.11min，在此條件下，蜂膠總黃酮得率理論上可達13.20%。考慮到實際操作的可行性，將蜂膠總黃酮的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎上修正為：乙醇濃度70%，液固比15∶1，超聲功率80%，超聲時間25min。以優化條件進行驗證，共進行3次實驗，驗證實際平均值為13.07%，比優化前的蜂膠總黃酮得率11.39%提高了9%。實驗驗證值與預測值較為接近，證明響應面分析法得到蜂膠總黃酮提取條件真實可靠。

4.結論

將響應面分析應用于蜂膠總黃酮提取工藝的研究，采用合理的試驗設計對提取工藝進行全面研究，依據回歸分析確定各工藝條件的影響因子，從而確定蜂膠總黃酮提取的最佳條件為乙醇濃度72%，液固比15∶1，超聲時間25min，超聲功率82%，比優化前的蜂膠總黃酮得率提高了9%。利用此工藝既可縮短提取時間，又能節約成本，試驗結果科學、可靠，為充分開發和利用蜂膠資源提供了科學依據。

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安硯波（1981-），男，助理講師，研究方向：中藥藥理。

王浩（1977-），女，副教授，研究方向：藥理學。