功能基因組學驅動蜜蜂系統生物學研究

劉振國王紅芳王 穎郭興啟李興安胥保華（山東農業大學動物科技學院，泰安708；山東農業大學生命科學學院，泰安708；吉林省養蜂科學研究所，吉林08）

功能基因組學驅動蜜蜂系統生物學研究

劉振國1王紅芳1王 穎1郭興啟2李興安3胥保華1
（1山東農業大學動物科技學院，泰安271018；2山東農業大學生命科學學院，泰安271018；3吉林省養蜂科學研究所，吉林132108）

在生命科學研究蓬勃發展的后基因組學時代，系統生物學已成為研究復雜生命現象的重要手段和研究熱點。以高通量組學技術為技術平臺，研究特定生理狀態下大量基因、蛋白質或代謝產物等生物大分子的表達模式變化規律，有助于建立與生物表型變化的相關性，為探究生理過程的分子調節機制提供依據。本文總結了廣泛應用的多種組學的研究進展，同時對該技術在蜜蜂領域的研究加以綜述，為蜜蜂系統生物學研究提供重要參考資料。

蜜蜂；系統生物學；功能基因組學

系統生物學（systems biology）是研究生物系統中所有不同性質的組成成分（基因、mRNA、蛋白質、生物小分子等）的構成、以及在特定條件下這些組分間的相互關系的學科。顯然，系統生物學是以整體性研究為特征、以實現從基因序列到功能網絡、到細胞、到組織、到個體的各個層次的整合為研究目標的綜合學科，以期復雜的生理條件下可靠地反映出生物系統的真實性。然而，針對單一方向研究生命科學無法解釋系統生物學問題，而以個體或群體為單位，針對生命過程中全部基因、蛋白質表達模式或產物代謝途徑的組學研究應運而生。為基因組學研究提供了新的視點，極大地豐富了后基因組學方面的研究手段，使得系統生物學與細胞生物化學緊密聯系在一起，揭示基因間、基因與環境互作關系，為闡明致病機制、遺傳變異、進化過程等生物學所面臨和亟待解決的問題提供大數據支持。

蜜蜂是重要的授粉昆蟲和模式生物。近年來，生態環境復雜多變使得蜜蜂的生存面臨嚴峻的考驗，種群數量銳減危害了農作物生產和生態多樣性［1］。資料顯示，群體崩潰紊亂（Colony collapse disorder，CCD）導致美國蜂群2008年保有量較1947年驟降了近61%［2］，這一比例在2014年下降為42.1%，但其原因尚未清晰。蜜蜂的學習和記憶等生物行為學一直受到關注。蜜蜂的基因組測序完成［3，4］，促進了以高通量組學技術為手段的蜜蜂系統生物學研究，本文綜述了近年來廣泛應用的基因組學分析技術的研究進展及其在蜂學研究領域的應用。

1　基因組學研究方法

基因組（genome）是研究基因組及其功能的學科。如今涉及生命科學的研究大多是基于基因組學科之上而發展起來的，帶動了該領域的研究在觀念認識和技術方法上的飛躍。隨著測序技術的不斷進步，基因組學成果日新月異。以Roche公司的454測序平臺、Illumina公司的Solexa測序系統以及ABI公司的SOLID測序系統為代表的新一代測序技術，降低測序成本的同時極大地提高了測序速度，拓展了基因測序的應用范圍，尤其促進了系統生物學研究和分子診斷方法的革新。為基因組學、轉錄組學、宏基因組學研究等方面帶來全新的變化，并逐步深入到微生物學研究領域中［5］，而在腸道微生物的研究中提出了宏基因組學（Megagenomics）和宏蛋白質組學（Metaproteomics）的概念［6］，擺脫了微生物培養技術瓶頸的局限性。而腸道微生物無論是從菌體數量還是編碼基因數目上都遠超機體本身，因此被認為是機體除自身基因組外的第二套基因組，其組分變化與疾病健康的關系等在研究中受到重視。腸道微生物在營養物質代謝、抵抗某些病原菌的侵襲和增強機體免疫力等方面具有重要作用［7］，為蜜蜂健康養殖、環境評價等提供了新思路［8］，極大地豐富了后基因組學方面的研究手段，使得系統生物學與細胞生物化學緊密聯系在一起，揭示基因間、基因與環境互作關系，為闡明致病機制、遺傳變異、進化過程等生物學所面臨和亟待解決的問題提供大數據支持。

蜜蜂是典型的社會性昆蟲，其高度組織、分工明確的社會形態是由染色體倍數和基因選擇性表達所控制的。同時蜜蜂的智慧也常常令人感到驚嘆，所以通過蜜蜂系統生物學的研究，不僅揭示了蜜蜂起源和進化的奧秘，同時也加深了對蜜蜂社會行為的理解。自2006年西方蜜蜂（Apis mellifera）全基因組測序公布以來，蜜蜂科學研究亦進入后基因組學時代，功能基因組學研究使得蜜蜂生命科學的研究逐步從單個基因擴大到全基因組的修飾、表達調控和功能研究，建立了生物大分子物質變化與機體表型之間的關聯性，極大地促進了后基因組時代蜜蜂生理生化、營養需求、病蟲害防治、健康福利等方面的研究，也為解決蜜蜂面臨的諸多威脅制定防護策略。

功能基因組學（functional genomics）是確定基因組所有基因及其產物的生物學功能的科學［9］。隨著測序技術的不斷革新，目前涉及關鍵作物、畜禽、模式生物和靈長類等全基因組序列已測序完成并相繼公布（表1），使得人們全面了解測序物種的基因結構組成、表達調控、進化變異等信息，極大地促進了系統生物學的深入研究，為解決全球糧食、能源及工業原料短缺問題、促進農業增產增效、加速新品種培養、制定疾病解決方案具有重要戰略意義。

宏基因組學（Megagenomics）概念，使研究者們運用深度測序手段對特定環境中的微生物群落進行大規模分析，研究微生物群落多樣性及評估其代謝功能［10，11］，以期探索微生物間、微生物與宿主間互利共生、相互競爭的動態平衡的復雜關系。美國科學院院士南?！つm（Nancy Moran）開辟了蜜蜂腸道微生物學的研究［12］，奠定了蜜蜂腸道微生物系統生物學研究的基礎，研究發現，腸道微生物多樣性的變化從營養代謝以及疾病免疫等多方面影響著傳粉昆蟲的健康狀況和種群演化。

2　基因組學在蜜蜂系統生物學中的研究進展

2.1基因組學研究奠定了蜜蜂模式生物的地位

蜜蜂作為重要的授粉昆蟲和模式生物，是繼果蠅（Drosophila melanogaster）、蚊子（Anopheles gambiae）之后第三種全基因組被破譯的昆蟲，其基因組信息先后于2006年（意大利蜜蜂，A.mellifera）［3，13］和2014年（東方蜜蜂，A.cerana）［4］公布，發現蜜蜂（A.mellifera）具有的16對染色體中包含約2.6億個堿基對（約為人類基因組的1/10），編碼約1萬個有效基因，比果蠅和蚊子的基因總數少30%左右。蜜蜂基因組約有170個與氣味感受器有關的基因，是果蠅和按蚊的2倍；而與嗅覺感受器相關的基因只有10個，遠不及果蠅的68個和按蚊的76個［14］，這與蜜蜂需要通過氣味辨識敵我和尋找合適的花朵等行為有關。另外，蜜蜂擁有的個體免疫相關基因數量只有果蠅和蚊子的1/3［15］，但是它們有一套完整的被稱之為“social immunity”［16］的協作性為抵御蜂巢內的病蟲害，包括清潔巢房、梳理行為等［17］。另外，工蜂將具有抗菌功效的蜂膠涂抹在巢房內壁，導致蜜蜂免疫相關基因較少［18］。表皮碳水化合物合成系統、Notch信號通路相關基因被認為是蜜蜂抵御細菌侵染的有效基因［19，20］。

社會性的蜜蜂為研究神經科學、免疫學、行為學和進化學等提供良好的素材，是極高科研價值的模式生物。隨著蜜蜂全基因組學研究的不斷深入，基因功能和調控機制成為新的研究熱點。在漫長的進化過程中，蜜蜂與其他物種一樣，被不斷選擇演變，繁衍成昆蟲綱中“高級進化”的類群，依賴的是群體行為學。Sarma等［21］以西方蜜蜂、大蜜蜂和小蜜蜂這3個蜂種中研究具有舞蹈行為的采集蜂中樞神經系統為研究對象，發現蘑菇體中基因表達差異極大，而中腦和次級胸神經節則表達一致性很高，多數與新陳代謝和能量供應有關。從差異表達基因反映了不同蜂種巢內活動、社會生態和舞蹈行為的差別，也解釋了中腦和次級胸神經節在調節舞蹈行為中的作用方式，指出蘑菇體是控制學習、記憶和節律行為的重要組織。陳璇［22，23］對不同發育階段的三型蜂的全基因組miRNA測序結果表明，在4個樣本中ame-bantam、ame-mir-279c、ame-mir-750和amemir-14的表達量最高，預示這些miRNA可能在雌蜂L4和L5發育階段的基本生命活動中至關重要，并得到免疫系統（ame-mir-14）、大腦相關功能發育（ame-mir-34和ame-mir-317）的miRNA表達，為研究miRNA對蜜蜂發育、級型分化提供依據。秦秋紅［24］通過利用miRNA測序技術和Solexa數字基因表達標簽分析技術（DGE）分析了迷宮視覺對東、西方蜜蜂miRNAs和mRNAs的表達影響，認為前者對顏色和光柵圖形的學習與記憶能力均顯著強于后者。研究發現處理組40差異表達的miRNAs和45個差異表達基因（共388個）上調表達；得到一些與神經學習記憶有關的miRNAs，如miR-124，let-7，miR-9a和mir-1000等，和差異表達mRNA，如GABAA beta、煙堿型乙酰膽堿受體、TWKSPDIVIRFa-containing神經肽和突觸結合蛋白等，分析了MAPK/ERK途徑對蜜蜂記憶中的作用，闡述了西方蜜蜂經迷宮視覺學習后大腦內miRNAs和mRNAs的表達量差異，為研究蜜蜂大腦學習記憶等神經功能奠定基礎。

表1　基因組信息公布的主要物種①

2.2基因組學研究提供了蜜蜂進化水平的依據

基因組學是研究物種進化和分類的重要手段。一般認為蜜蜂起源于非洲［25］，可追溯到1億年前的恐龍時代，但也有證據表明蜜蜂起源于30萬年前的中亞。Wallberg等［26］通過研究世界各地14個居群的140種蜜蜂的SNP的遺傳變異模式，結果顯示蜜蜂具有高水平的遺傳多樣性，并對蜜蜂可能起源于亞洲這一觀點提供了基因組序列進化樹數據支持。此外，蜜蜂屬9個種中，有8個種在東南亞地區仍然有繁盛的野生種群［27］。因此，該研究從進化和遺傳適應性角度為蜜蜂研究提供了新的見解，為研究抗逆性和氣候適應性的生物學機制提供分子基礎，有助于制定全球范圍內的蜜蜂保護策略。Pinto等［28］利用線粒體DNA tRNAleu-cox2和SNP測序數據分析了歐洲黑蜂保種群體的基因多態性和滲透水平，并與非保種群進行比較。研究發現，非保種群基因滲透率達30%，高于保種群的8%，反應出前者SNP變異程度較大，并認為SNP技術是檢驗保種群體的基因多態性有效手段。養蜂活動和貿易促進了地區間蜂種的基因交流等構建了“祖先信息標記”（AIMs，ancestry-informative markers）計算模式，包含Fst及其異值化檢測、Delta值、In和PCA等參數，為研究歐洲蜂的品種鑒定和雜合水平提供依據，有助于制定蜜蜂保種規劃。Chapman等［30］在非洲蜜蜂、東方蜜蜂、歐洲蜜蜂和西歐蜂種獲得了95個差異的SNP，為檢測蜂群中非洲蜜蜂血統所占比例和篩選優良生產性狀的蜂種提供可靠依據。

2.3基因組學研究推動了蜜蜂健康養殖的發展

宏基因組在腸道微生物研究中的應用廣泛。Cox-Foster等［31］運用基于16S rDNA和18S rDNA高通量焦磷酸技術的測序手段對世界范圍內多個地區的蜜蜂腸道微生物進行研究，發現IAPV與CCD的發生甚為密切，后者在各地造成了不同程度的蜂群崩潰，嚴重威脅蜂業發展以及生態平衡。Cornman等［32］以西方蜜蜂白堊病的致病菌子囊球菌［33］（Ascosphaera apis）的轉錄組水平研究致病機理，通過454焦磷酸測序得到拼接成10，087條contigs，預測得到6，992個編碼蛋白的基因，發現了一些編碼毒力因子和水解酶（特別是幾丁質酶），有助于病菌突破宿主的防御機制（如幼蟲的食圍膜和蛹期的角質層），最終使宿主致死。分析表明黃曲霉毒素-柄曲霉素（Aflotoxin-Sterigmatocystin，ST）合成通路中，AflR（AAPI16014）是調節AF/ST的轉錄，StcU/ Verl（AAPI15087）在曲霉菌的毒素合成中起重要作用。Aufauvre等［34］通過測定微孢子蟲和殺蟲劑對中腸轉錄組蜜蜂的影響，發現殺蟲劑的長期作用沒有顯著影響解毒相關基因，但會抑制免疫相關基因的表達。微孢子蟲的侵染會強烈的改變中腸的免疫水平和海藻糖含量。李繼蓮等［35］通過Roche 454高通量測序平臺測定了分布在我國境內的青海、內蒙古、廣西、四川、安徽等地區28種熊蜂的腸道細菌的16S的V6-V8區域，結果表明熊蜂腸道微生物存在兩種保守的生態型：一種是由Gilliamella和Snodgrassella菌群組成，這兩類菌群在蜜蜂中也存在；另一種生態型主要是由環境性菌群組成，而且含有一些條件致病菌如哈夫尼菌屬（Hafnia）和沙雷氏菌屬（Serratia）。這兩種不同生態型在熊蜂腸道微生物中的出現顯示出與哺乳動物腸道微生物生態型分化的高度一致，對于熊蜂物種的健康和種群動態具有潛在的影響，為進一步挖掘這些特定腸道共生菌的功能奠定基礎，同時也為我國蜂種資源的多樣性保護提供參考。

3　小結

功能基因組學研究已滲透到生命科學的眾多領域，從腸道微生物組到傳染性病毒，從發育生物學到癌癥發生機制等多個方面，展現了蓬勃的生機及廣泛的應用性，為系統生物學研究提供了強有力的工具。如今，高通量測序已從實驗室進入了臨床檢驗，借助分子標記物進行患病風險評估，做到有效的監測、預警和干預，蜜蜂研究中尚有諸多問題亟待解決。因此，將高通量組學技術運用到蜜蜂研究領域，有助于探索蜜蜂遺傳因素與環境因素作用方式，促進抗病育種、發展健康養殖和保持物種多樣性，對維持生態平衡具有重要意義。

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Functional genomics based application stimulate the future prospects in honeybee systems biology research

Liu Zhenguo1，Wang Hongfang1，Wang Ying1，Guo Xingqi2，Li Xing an3，Xu Baohua1
（1 College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China；2 College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China；3 Jilin Provincial Institute of Apicultural Science，Jilin 132108，China）

High-throughput studies of biological systems are rapidly accumulating a wealth of'omics'-scale data which have allowed researchers to better assess the complexity and diversity of the system biology in the post-genome era.Omics-based applications such as genome，transcriptome and proteome have been performed in various bioscientific researches for the integrated visualizations that give biological insight into the profiles of abundant of gene，protein and metabolite etc，well benefit the construction of the relationship between the traits and biomacromolecule as well as the molecular regulation mechanism of certain physiological processes.The current understanding and processing of widely used omics-based applications are summarized in this review，also with emphasis on its performance and achievement in honeybee research.

honeybee；systems biology；functional genomics

國家自然科學基金項目（No.31572470）；山東省農業良種工程項目“優質高產蜜蜂及蠶桑新品種培育”（2014-2016）；國家蜂產業技術體系建設專項資金（No.CARS-45）

劉振國（1984-），男，在站博士后，主要從事蜜蜂營養與分子生物學研究，E-mail：lzhenguo_001@163.com

胥保華（1965-），男，教授，主要從事蜜蜂營養與分子生物學研究，E-mail：bhxu@sdau.edu.cn