大腸埃希菌耐藥特征及質粒介導喹諾酮耐藥基因分布

潘 玫， 陳 山， 李 穩， 劉臣彪， 石 媛

大腸埃希菌耐藥特征及質粒介導喹諾酮耐藥基因分布

潘 玫1， 陳 山2， 李 穩1， 劉臣彪1， 石 媛1

目的 調查大腸埃希菌分離株的耐藥特征及質粒介導喹諾酮耐藥基因流行狀況。方法 紙片擴散（K-B）法進行藥物敏感試驗，采用雙紙片法檢測產超廣譜β內酰胺酶（ESBL），聚合酶鏈反應（PCR）檢測qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac（6' ）-Ib、qepA基因，限制性酶切反應確定aac（6' ）-Ib-cr基因型。結果 179株大腸埃希菌中95株ESBL表型確證試驗陽性，檢出率為53.1%；產ESBL菌株未見對美羅培南耐藥，對亞胺培南耐藥率極低（1.1%），對阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦耐藥率皆低于30%，對哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、氨曲南、甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率皆高于70%，對慶大霉素、頭孢他啶、環丙沙星、左氧氟沙星耐藥率在60%～70%；PCR擴增結果顯示產ESBL菌株，具有qnr基因9株（9.5%），其中qnrA 2株、qnrB 5株、qnrS 2株。非產ESBL菌株，具有qnrB基因3株（3.6%）；酶切反應顯示產和非產ESBL菌株具有aac（6' ）-Ib-cr基因分別為21株（22.1%）和5株（6.0%）。所有菌株皆未檢測到qepA基因。結論 產ESBL大腸埃希菌呈現多重耐藥趨勢，質粒介導喹諾酮耐藥基因以aac（6'）-Ib-cr基因型為主。

大腸埃希菌； 超廣譜β內酰胺酶； 質粒介導喹諾酮耐藥； 基因

氟喹諾酮類藥物是臨床廣泛應用的抗感染藥物，伴隨這類藥物應用，細菌對其耐藥已迅速發展。在腸桿菌科細菌中，最初喹諾酮耐藥機制為染色體介導，包括藥物靶位改變、膜滲透性改變和（或）外排泵系統過度表達。至上個世紀90年代末，發現質粒介導喹諾酮耐藥（PMQR）機制的存在，目前PMQR基因，如qnr，aac（6'）-Ib-cr及qepA等在臨床菌株中流行以及對細菌耐藥影響已引起廣泛的重視。

大腸埃希菌為臨床常見的病原菌， PMQR基因在產超廣譜β內酰胺酶（ESBL）的大腸埃希菌高度流行已在世界范圍內得到認同。對大腸埃希菌耐藥狀況和氟喹諾酮耐藥基因分布的調查，對臨床更合理應用氟喹諾酮類抗菌藥物，減少其耐藥菌株的產生具有重要意義。本研究的目的是評價大腸埃希菌（包括產ESBL和非產ESBL菌株）耐藥狀況及PMQR基因流行分布特征。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 179株分離自山東中醫藥大學附屬醫院2012年10月—2013年12月臨床標本，同一患者同一部位僅用首次分離菌株。標準菌株由山東省臨檢中心饋贈。聚合酶鏈反應（PCR）陽性對照株皆由山東省立醫院王勇博士提供。

1.1.2培養基與藥敏紙片 MH培養基、藥敏紙片為OXOID產品。

1.1.3儀器與試劑 鑒定系統為法國生物梅里埃公司產品GN鑒定板條。細菌鑒定儀為VITEK2-Compact全自動快速微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司產品）。PCR擴增儀為 7 300 Real Time PCR System（美國Applied Biosystems公司產品）。電泳儀為Power Pac Basic 型電泳儀（美國Bio-Rad公司產品）、凝膠成像分析儀為美國UVPGDS-8000。PCR引物為博尚生物公司合成，反應體系為大連寶生物有限公司產品。BstF5I為立陶宛MBI公司產品。

1.2方法

1.2.1藥物敏感試驗及ESBL表型確證試驗 采用美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI） 2014年版推薦的紙片擴散（K-B）法進行藥敏試驗及雙紙片確證法［1］。

1.2.2PCR模板制備 挑純培養菌落置入0.5 mL離心管內（內預置200 ng/mL 蛋白酶K溶液200 μL） ， 95 ℃水浴10 min ，離心（17 000×g） 30 s。上清液即為基因檢測的模板液， -20 ℃冰箱保存備用。反應體系、反應條件、引物序列見表1。

表1　PCR引物及反應條件Table 1 Primers used in PCR and references

1.2.3限制性酶切片段 應用BstF5I限制性酶消化所有aac（6'）-Ib陽性的擴增產物，由于aac （6'）-Ib-cr缺乏酶切位點，酶切產物進行電泳，缺乏272-bp和210-bp DNA酶切片段［5］。

1.2.4藥敏數據分析 采用WHO 推薦的WHONET 5. 6軟件對數據進行統計分析。

2.1大腸埃希菌ESBL表型檢測及耐藥狀況

179株大腸埃希菌中，表型確證試驗結果為產ESBL 95株，占53.1%，非產ESBL 84株，占46.9%，產與非產ESBL菌株耐藥率見表2。

2　結果

表2　大腸埃希菌耐藥率Table 2 Resistance profile of E. coli in terms of production of extended-spectrum beta-lactamases （%）

2.2大腸埃希菌中qnr，aac（6'）-Ib-cr，qepA基因分布

179株大腸埃希菌中，檢測出qnr 12株（6.7%）；aac（6'）-Ib 72株（40.2%），其中aac（6'）-Ib-cr變體26株（14.5%）；未見攜帶qepA基因菌株。具體基因分布見表3。PCR擴增結果見圖1。

表3　大腸埃希菌株中qnr，aac（6'）-Ib-cr，qepA基因分布Table 3 Distribution of qnr， aac（6'）-Ib-cr， and qepA genes in E. coli isolates

圖1　PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

3　討論

大腸埃希菌是臨床常見的感染病原菌，質粒介導的ESBL是其對β內酰胺類抗生素主要耐藥機制， 因此ESBL檢測對于耐藥菌株流行病學調查及醫院感染控制非常必要。本次檢測大腸埃希菌產ESBL菌株占53.1%，低于同期衛生部全國細菌耐藥檢測網報告數據（68.2%）和上海市耐藥監測網數據（61.3%），與同時期北京協和醫院報道53.0%及CHINET細菌耐藥監測數據54.0% 基本一致［6-9］。且高于國外報道的11.9%～49.4%［10-12］。

ESBL基因位于質粒上，而質粒可以通過接合、轉化、轉導、整合等形式在同種或異種細菌間傳播，并可攜帶其他耐藥基因， 故產ESBL細菌不僅對青霉素類、頭孢菌素類耐藥， 而且對氟喹諾酮類、氨基糖苷類及磺胺類藥物耐藥，從而限制臨床抗感染治療方案的選擇，增加抗感染治療失敗的風險。本次研究結果顯示，產ESBL菌株對哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、氨曲南耐藥率皆高于90%，對頭孢他啶耐藥率也高達68.4%，表明這些藥物已經不適合作為抗大腸埃希菌感染的經驗用藥。而耐藥率60%～75%的藥物為：慶大霉素、環丙沙星、左氧氟沙星和甲氧芐啶-磺胺甲唑，結果與HU等［13］研究產酶菌株耐藥數據相比（依次分別為36.7%，80%，83.3%，66.7%），本研究中菌株對慶大霉素耐藥率更高，對環丙沙星、左氧氟沙星略低，甲氧芐啶-磺胺甲唑與之較為接近，從而表現出不同國家和地區的差異。本研究菌株對酶抑制劑復合制劑藥物中頭孢哌酮-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦耐藥率僅為29.5%和24.2%，體現復合制劑有較好的抑制酶活性及抗菌活性。同為氨基糖苷類藥物，大腸埃希菌對阿米卡星和慶大霉素耐藥率明顯不同，國內外數據報道也顯示出對阿米卡星耐藥率遠低于慶大霉素耐藥率（5.0% 與 42.6%）［13］，（ 3.3% 與 36.7%）［14］，（12.5% 與65.0%）［15］，此可能與阿米卡星和慶大霉素對鈍化酶穩定性不同相關。頭孢西丁作為頭霉素類相對頭孢菌素對產ESBL菌株的抗菌活性較強，細菌對其耐藥率為28.4%。本次研究出現大腸埃希菌對亞胺培南耐藥的菌株，盡管只占0.6%（1/179），但仍要引起重視，需要進一步研究耐藥機制，防止耐藥株的擴散。

伴隨喹諾酮類藥物廣泛應用，細菌對其耐藥率呈現上升趨勢，染色體上基因突變和膜滲透性改變導致喹諾酮類藥物高水平的耐藥，但眾多學者對于細菌多重耐藥及水平傳播現象，尤其對于氟喹諾酮類耐藥與產ESBL菌株相關性的方面給予密切關注。在1998年，發現質粒介導可水平傳播的qnr基因導致喹諾酮耐藥，其機制為qnr基因編碼蛋白可結合在喹諾酮藥物作用的靶位，從而保護菌體DNA。隨后幾個新的PMQR基因的耐藥機制被發現，包括：aac（6'）-Ib-cr基因和qepA基因等。aac（6'）-Ib-cr基因編碼乙酰轉移酶，作用于藥物哌嗪酸結構的仲胺，阻止藥物乙酰化靶位，而qepA基因編碼QepA蛋白為新外排泵，具有降低藥物在菌體內積聚作用。雖然這些基因引起細菌對喹諾酮類藥物低水平耐藥，但其與染色體編碼的旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ突變具有相關性，而后者可造成高水平氟喹諾酮耐藥。

本次研究結果顯示：大腸埃希菌攜帶qnr基因占6.7%（12/179）， aac（6'）-Ib-cr占14.5%（26/179），與國內JIANG等［4］學者研究數據8.0% 和 9.9% 結果相近，但高于挪威和瑞典地區研究數據，0.85%（3/354），9.0%（32/354）［2］，此可能與不同國家抗菌藥物應用范圍和程度有關。同時實驗結果也表明：在產ESBL大腸埃希菌中qnr基因檢出率為9.4%（9/95），高于FERJANI等［15］研究結果7.5%，墨西哥地區1.4%（ 2/136）［16］，西班牙報告的1.1%［17］。研究顯示qnrB在qnr基因中占優勢。同時本研究aac（6'）-Ib-cr基因在產酶菌株中檢出率為22.1%（21/95），與其他國家研究數據相比，較高檢出率有：墨西哥61.7%（84/136）［16］，韓國36.5%，（23/63）［18］，巴西里約熱內盧44.0%（11/25）［19］，日本檢出率較低為13.0%（6/46）［20］，進而顯示出不同地區基因流行特征，表明對本地區耐藥基因流行病學調查的重要性。本次觀察到產ESBL菌株與非產酶株間，qnr基因的檢出結果（9.4%對3.6%）差異無統計學意義（P＞0.05），此與其他學者報道不同［2，18，20-21］，其原因可能與本次調查區域qnr流行水平較低及研究標本量較少有關； 而aac（6'）-Ib-cr基因，兩者具有明顯的差異（22.1%對5.9%）差異具有統計學意義（P＜0.01），表明產 ESBL菌株通過攜帶aac（6'）-Ib-cr基因，在多種抗菌藥物壓力下，具有更大的進化優勢，表現出多重耐藥特征。

盡管PMQR基因自身促進低水平喹諾酮耐藥，但PMQR基因的流行與拓撲異構酶突變及高水平氟喹諾酮耐藥具有相關性［20- 21］，可以促進最初敏感的菌株獲得高水平的耐藥，并由于PMQR基因可與產ESBL的某些基因位于同一質粒上，在菌株及菌種間水平傳播［15-16］，進而加速了菌株多重耐藥的形成和傳播。

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Resistance profile and prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance genes in Escherichia coli isolates

PAN Mei， CHEN Shan， LI Wen， LIU Chenbiao， SHI Yuan. （Department of Laboratory Medicine， Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250011， China）

Objective To investigate the resistance profile and the prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance （PMQR）genes in Escherichia coli isolates. Methods Antimicrobial susceptibility testing was conducted by Kirby-Bauer method. Double disc method was used to detect extended-spectrum Beta-lactamases （ESBLs） phenotypically. The qnrA， qnrB， qnrC， qnrD， qnrS，aac（6' ）-Ib， and qepA genes were identified by polymerase chain reaction （PCR）. The aac（6' ）-Ib-cr gene was confirmed by restriction endonuclease reaction. Results The overall prevalence of ESBLs-producing strains was 53.1% （95/179） in Escherichia coli isolates. The ESBLs-producing strains showed no resistance to meropenem and the lowest resistance rate （1.1%） to imipenem， followed by amikacin， piperacillin-tazobactam， and cefoperazone-sulbactam （16.8%， 24.2%， and 29.5% resistant respectively）. More than 70% of the ESBLs-producing strains were resistant to piperacillin， cefotaxime， ceftriaxone， aztreonam， and trimethoprim-sulfamethoxazole，while 60%-70% were resistant to gentamicin， ceftazidime， ciprofloxacin， levofloxacin and levofloxacin. PCR results showed that qnr gene was identified in 9 （9.5%） of the ESBLs-producing E. coli strains， including qnrA in 2 strains， qnrB in 5 strains and qnrS in 2 strains. And qnrB gene was identified in 3 （3.6%） non-ESBLs-producing E. coli strains. Restriction endonuclease reaction revealed that aac（6' ）-Ib-cr gene was positive in 21 （22.1%） ESBLspositive strains and 5 （6.0%） ESBLs-negative E. coli strains，respectively. qepA gene was not identified in any isolate. Conclusions ESBLs-producing E. coli showed resistance to multiple antimicrobial agents. aac（6' ）-Ib-cr is the primary genotype of PMQR.

Escherichia coli； extended-spectrum betalactamase； plasmid-mediated quinolone resistance； genotype

·論著·

R 378.21

A

1009-7708（2016）01-0015-05

10.16718/j.1009-7708.2016.01.004

山東省科技發展計劃項目（2012GGB14100）；山東省臨床重點專科建設項目（魯衛醫字［2013］26號）。

1. 山東中醫藥大學附屬醫院檢驗科，濟南 250011；2. 山東省立醫院檢驗科。

潘玫（1964—），女，醫學碩士，副主任技師，主要從事臨床病原微生物研究。

潘玫，E-mail： sdjnpm2006@126.com。

2015-06-11

2015-07-31