第三芽孢梭菌致顱內感染的檢測與分析

張愛平， 鄒玖明， 尹艷華

第三芽孢梭菌致顱內感染的檢測與分析

張愛平， 鄒玖明*， 尹艷華

目的 對分離的1株耐氧生長的厭氧菌進行鑒定及藥敏分析。方法 利用API 20A進行生化鑒定、瓊脂稀釋法進行藥物敏感性試驗、聚合酶鏈反應（PCR）和測序技術分析該菌的16SrRNA基因。頭孢硝噻吩紙片法檢測細菌β內酰胺酶，PCR擴增β內酰胺酶cfxA耐藥基因。結果 經鑒定，該株厭氧菌為第三芽孢梭菌，經16SrRNA分析與美國國家生物技術信息中心數據庫中第三芽孢梭菌相似性達100%，藥敏結果顯示該菌對亞胺培南、四環素、甲硝唑敏感，對氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢替坦耐藥。結論 該株厭氧菌為第三芽孢梭菌，攜帶cfxA耐藥基因。

第三芽孢梭菌； 基因； cfxA； 藥敏試驗

第三芽孢梭菌是革蘭染色陽性的芽孢桿菌，屬于芽孢梭菌屬。該菌寄生于哺乳動物及人類口腔、腸道中，可隨糞便排出體外，在外界土壤中廣泛存在。由于該菌不產毒素，一直以來認為沒有致病意義。1917年HENRY［1］從戰傷患者壞疽組織首次分離出第三芽孢梭菌，但不能肯定其致病性；直到1936年KING等［2］從敗血癥患者血液中分離出該菌，才首次闡明了其在人類疾病中的致病意義。2014年12月我院神經外科1例顱內感染患者腦脊液中分離出1株第三芽孢梭菌，現將檢測過程和藥敏試驗結果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 患者，男，52歲。因“頭痛、頭暈伴發熱2 d”入院。患者2 d前頭皮外傷，已在我院門診行清創縫合，但之后出現頭痛、頭暈伴體溫升高。顱內穿刺顯示顱內壓增高（2.8 kPa），頭皮傷口縫合處微紅、腫，有滲出液。入院初即采集傷口滲出液、腦脊液及血液標本進行微生物學檢查。

1.1.2試劑與儀器 API 20A試劑條購自法國生物梅里埃公司，聚合酶鏈反應（PCR）引物、DNA標記、Taq酶、各種限制性內切酶均購自大連寶生物公司，其他生化試劑購自美國SIGMA公司，序列分析在上海生工生物工程有限公司進行，Prism 7300型PCR擴增儀為美國ABI公司產品。血培養瓶，哥倫比亞血瓊脂干粉、布氏瓊脂為生物梅里埃公司產品。

1.2方法

1.2.1生化鑒定及藥敏試驗 將血培養瓶分離到的菌株轉種至哥倫比亞血平皿，35 ℃培養48～72 h，按照API 20A試劑條操作程序進行生化鑒定。抗菌藥物敏感性試驗采用瓊脂稀釋法檢測，具體操作及判斷折點參考2012 CLSI M11-A7文件，厭氧環境孵育48 h后讀取最低抑菌濃度（MIC）值。

1.2.216SrRNA鑒定 試驗菌株接種哥倫比亞血平皿，35 ℃培養48～72 h，吸取1 mL菌液，采用細菌基因組DNA提取試劑盒制備模板，－20 ℃冰箱保存備用。16SrRNA的PCR擴增采用通用引物序列，產物大小944 bp，擴增產物測序后進行BLAST序列比對分析，見表1。

表1　16SrRNA、cfxA基因引物序列Table 1 Primers used in PCR assay for 16SrRNA and cfxA genes

1.2.3β內酰胺酶及其耐藥基因檢測 頭孢硝噻吩（OXOID公司產品）紙片法檢測細菌β內酰胺酶，PCR擴增β內酰胺酶cfxA耐藥基因，引物參照文獻合成［3-4］。核酸提取： 取布氏瓊脂上生長48 h菌落懸于100 μL無菌去離子水，調整濁度至1.5麥氏單位，蓋緊離心管于震蕩器上震蕩混勻，加熱96 ℃，10 min，立即轉移冰浴5 min后，12 000 r/min離心5 min，上清液作為擴增模板液。反應條件：94 ℃5 min預變性，94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃90 s，25個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，Goldenview染色，凝膠成像儀讀取結果。

2　結果

2.1培養結果菌落特征及生化鑒定

血液培養顯示無細菌生長，傷口滲出液及腦脊液培養均分離出革蘭陽性桿菌。

腦脊液及傷口滲出液培養各分離到1株細菌在哥倫比亞血平皿上生長緩慢，24 h后菌落針尖樣大小，48～72 h方可見直徑1～2 mm菌落，扁平透明，邊緣光整，不溶血。厭氧和需氧環境培養，菌落革蘭染色為陽性桿菌，但易脫色，厭氧培養條件下可見未染色芽孢，而需氧培養條件下未見，見圖1。API 20A生化鑒定均為第三芽孢梭菌，生物編碼一致，為47746023，符合率99.99%，該2株菌判斷為同一株細菌。藥敏試驗結果顯示對亞胺培南、四環素、甲硝唑敏感，而對氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢替坦耐藥，見表2。

圖1　第三芽孢梭菌革蘭染色圖（1000×）Figure 1 Representative gram stain images of Clostridium tertium（1000×）

表2　第三芽孢梭菌抗菌藥物敏感試驗結果Table 2 Susceptibility of the Clostridium tertium strain to antimicrobial agents （mg/L）

2.216SrRNA種屬鑒定

經過16SrRNA保守區基因擴增，電泳結果顯示950 kb處有一清晰對應條帶，見圖2。將擴增后產物測序，BLAST序列比對顯示與NCBI數據庫中第三芽孢梭菌相似性達100%，為同一種屬。

圖2　16SrRNA保守區基因電泳結果Figure 2 Electrophoretogram of 16SrRNA gene amplified by PCR

2.3β內酰胺酶及其基因檢測

來源于傷口滲出液及腦脊液的2株第三芽孢梭菌的β內酰胺酶檢測均為陽性。PCR結果顯示cfxA基因均陽性，見圖3。

圖3　cfxA基因檢測電泳結果Figure 3 Electrophoretogram of cfxA gene amplified by PCR

3　討論

依靠細菌的保守區基因設計引物對細菌進行分子生物學鑒定是準確可靠的方法之一。16SrRNA基因序列分子在結構與功能上具有高度的保守性，可以實現快速、準確地對微生物進行分類鑒定。本研究中，2株不同來源分離菌株通過生化反應均鑒定為第三芽孢梭菌，16SrRNA 分析進一步驗證了表型結果。

由于該菌的生物學特性有異于其他種類細菌，因此很容易被錯誤鑒定或忽略。例如在革蘭染色的過程中該菌很容易被脫色而誤認為革蘭陰性桿菌，在鑒別上可以觀察在其他革蘭陰性菌選擇性平皿上（如麥康凱、含萬古霉素巧克力平皿）的生長情況來綜合判定，該菌不會在這類選擇性平皿上生長。此外，該菌不同于其他的厭氧芽孢梭菌，在有氧環境下也可以緩慢生長，具有一定的耐氧性，這是很重要的一點，因為在需氧環境分離的第三芽孢梭菌很容易被誤認為是乳桿菌或棒狀桿菌而被忽略。它們的區別在于乳桿菌不會形成芽孢，第三芽孢梭菌在厭氧條件下可以形成芽孢；棒狀桿菌屬觸酶試驗陽性，而第三芽孢梭菌觸酶試驗陰性；其他的芽孢梭菌往往在有氧環境下形成芽孢，而第三芽孢梭菌與之恰恰相反。

以往認為第三芽孢梭菌不產生毒素，因此難以肯定它的致病意義［5］。但近期越來越多的報道顯示，該菌在人類多種疾病中起著重要的作用。2011年，STEENSMA等［6］在1例糖尿病患者伴發壞死性軟組織感染病灶中分離出第三芽孢梭菌；2013年SALVADOR等［7］報道第三芽孢梭菌在急性白血病伴中性粒細胞減少發熱患者中引起急性血流感染；2015年，VIROT等［8］報道1例兩伊戰爭后30年由于體內金屬碎片殘留而引起繼發的第三芽孢梭菌骨關節感染。本例中，從患者頭皮傷口滲出液、腦脊液均分離出第三芽孢梭菌，提示該菌與患者傷口愈合不良、顱內感染有關。

研究顯示，第三芽孢梭菌感染主要與3個因素有關：腸黏膜屏障受損、中性粒細胞減少和β內酰胺類抗生素的過度使用（尤其是第三代廣譜頭孢菌素的使用）［9］。究其原因可能是因為第三芽孢梭菌定植于腸道，腸黏膜屏障受損有利于細菌侵入腸壁，隨血流侵入遠端部位，造成移位感染；中性粒細胞減少會降低機體的防御功能，不利于免疫系統對入侵細菌的吞噬殺滅；而廣譜抗生素的使用會造成腸道菌群失衡，間接損傷腸黏膜屏障。盡管第三芽孢梭菌感染的患者多伴有發熱，使用抗生素治療一定程度上亦利于降低體溫，但迄今為止沒有直接證據顯示發熱是因為該菌感染引起。本研究中，患者并不伴中性粒細胞減少，抗生素的使用距離發病間隔時間短暫，因此病原菌很可能不是來自于腸道定植細菌移位，而是來自于外環境：患者頭部縫合傷口感染，細菌經此途徑侵入，造成顱內感染。本研究中分離的第三芽孢梭菌對甲硝唑、氟喹諾酮類、亞胺培南敏感，而對青霉素、頭孢菌素類耐藥，基因檢測結果提示均攜帶cfxA基因。cfxA基因主要介導厭氧菌對β內酰胺類抗生素的耐藥性，在厭氧菌耐藥基因的水平傳遞中起著重要作用，在擬桿菌屬、普雷沃菌屬及二氧化碳嗜纖維菌中均有報道［10］。本例患者采用萬古霉素治療，病情好轉。

目前有關第三芽孢梭菌研究的臨床病例太少，盡管已經意識到其致病性，但該菌的毒力因子、致病機制、感染易感因素均不詳，還有待于進一步探討。

［1］HENRY H. An investigation of the cultural reactions of certain anaerobes found in wounds［J］. J Pathol Bacteriol， 2005，21（3）：344-385.

［2］KING BM， RANCK BA， DAUGHERTY FD， et al.Clostridium tertium septicemia［J］. N Engl J Med， 1963，269：467-469.

［3］CHAUDHRY R， VERMA N， BAHADUR T， et al. Clostridium sordellil as a cause of constrictive pericarditis with pyopericardium and tamponade［J］. J Clin Microbiol， 2011，49 （10）：3700-3702.

［4］FERNANDEZ-CANIGIA L， CEJAS D， GUTKIND G， et al. Detection and genetic characterization of β-lactamases in Prevotella intermedia and Prevotella nigrescens isolated from oral cavity infections and peritonsillar abscesses［J］. Anaerobe，2015，33：8-13.

［5］VANDERHOFSTADT M， ANDRE M， LONCHAY C， et al. Clostridium tertium bacteremia： contamination or true pathogen？ A report of two cases and a review of the literature［J］. Int J Infect Dis， 2010，14（Suppl 3）：e335-e337.

［6］ STEENSMA EA， ERTL CW， BURKE LH.Clostridium tertium isolated from a necrotizing soft tissue infection in a diabetic but otherwise nonimmunocompromised patient［J］. J Am Col Certif Wound Spec，2011，3（2）：42-44.

［7］SALVADOR F， PORTE L， DURAN L， et al. Breakthrough bacteremia due to Clostridium tertium in a patient with neutropenic fever， and identification by MALDI-TOF mass spectrometry［J］. Int J Infect Dis， 2013，17（11）：e1062-e1063.

［8］VIROT E， SERVIEN E， LAURENT F， et al. Reactivation of Clostridium tertium bone infection 30 years after the Iran-Iraq war［J］. BMJ Case Rep，2015，pii：bcr2014209169.

［9］MILLER DL， BRAZER S， MURDOCH D，et al. Significance of Clostridium tertium bacteremia in neutropenic and nonneutropenic patients： review of 32 cases［J］. Clin Infect Dis，2001，32（6）：975-978.

［10］GARCIA N， GUTIERREZ G， LORENZO M， et al. Genetic determinants for cfxA expression in Bacteroides strains isolated from human infection［J］. J Antimicrob Chemother，2008，62（5）：942-947.

Characterization of a strain of Clostridium tertium causing intracranial infection

ZHANG Aiping， ZOU Jiuming， YIN Yanhua. （Intensive Care Unit， Xiangyang Central Hospital， Xiangyang Hubei 441021， China）

Objective To identify an anaerobic strain isolated from a patient with intracranial infection， and characterize the strain in terms of antibiotic resistance and relevant genes. Methods The strain was identified by API 20A. Susceptibility to antimicrobial agents was tested by agar dilution method. PCR and sequencing analysis was used to analyze 16SrRNA gene. Nitrocefin test was used to determine the production of lactamases. Beta-lactamase cfxA gene was detected by PCR. Results This anaerobic isolate was confirmed as Clostridium tertium. Susceptibility testing showed that this strain was susceptible to imipenem， tetracycline，metronidazole， and vancomycin， but resistant to ampicillin， amoxicillin-clavulanate， and cefotetan. The sequence of 16SrRNA gene showed 100% homologous with that in NCBI database. Conclusions This anaerobic isolate is confirmed as Clostridium tertium carrying cfxA gene， which mediates resistance to beta-lactam antibiotics.

Clostridium tertium； resistance gene； cfxA； antimicrobial susceptibility testing

·論著·

R378.8

A

1009-7708（2016）01-0071-04

10.16718/j.1009-7708.2016.01.016

湖北文理學院附屬醫院 襄陽市中心醫院重癥醫學科，湖北襄陽 441021；*醫學檢驗部。

張愛平（1982—），女，本科，護師，主要從事醫院感染工作。

尹艷華，E-mail： 5650722273@qq.com。

2015-03-27

2015-07-21