閩產鉤吻資源分布及藥用部位的研究

石冬梅， 蘇燕評， 吳宏霞， 俞昌喜

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閩產鉤吻資源分布及藥用部位的研究

石冬梅1， 蘇燕評2， 吳宏霞3， 俞昌喜4

目的調查福建省鉤吻資源的分布情況，并確定鉤吻的最佳藥用部位。方法依據文獻記載和實地考察閩產鉤吻的生境與分布；正交設計試驗優化超聲提取鉤吻素子的工藝條件，采用高效液相色譜法測定鉤吻根、莖和葉中的鉤吻素子含量。結果閩產鉤吻資源主要集中分布于23°84′N～26°92′N、116°36′E～120°05′E、海拔800 m以下光照良好的山坡、路旁。超聲提取鉤吻素子的最佳條件為超聲功率250 W、時間20 min、溫度50 ℃、料液比1∶20。閩產鉤吻根和莖的鉤吻素子含量高，葉的含量較低。結論閩產鉤吻分布較廣，資源豐富；鉤吻的入藥部位以根和莖為佳。

福建； 鉤吻； 分布； 高效液相色譜； 藥用部位

鉤吻(GelsemiumelegansBenth.)為馬錢科胡蔓藤屬常綠木質藤本植物，俗稱斷腸草、野葛、毒根、大茶藥，全草入藥[1]。我國對鉤吻的使用歷史悠久，《神農本草經》始有記載。民間一直應用鉤吻原植物治療各類疼痛，尤其是慢性神經性疼痛與癌性疼痛。生藥鉤吻中的主要成分鉤吻素子有顯著鎮痛和治療類風濕性關節炎的功效，具有良好的成藥性[2-5]。目前鉤吻素子獲取的主要途徑就是從原植物中提取分離。因此，如何獲得鉤吻藥材、合理利用藥材，將其資源價值最大化，值得廣泛關注和深入研究。

從鉤吻中提取生物堿多采用煎煮法、熱回流等方法[6-8]。這些方法溶劑用量大、耗時長，不利于鉤吻素子含量的快速檢測。陳志惠等比較了索氏回流、常規浸提、超聲波3種方法提取鉤吻總堿，以超聲波提取法得率最高[9]。本研究采用正交設計試驗，優化超聲提取鉤吻素子的工藝條件；采用高效液相色譜法測定福建省不同產區鉤吻的根、莖和葉的鉤吻素子含量，以確定鉤吻的最佳藥用部位，為鉤吻素子工業化生產提供藥材及質量保證。

鉤吻在我國主要分布在浙江、福建、廣東、廣西、湖南、貴州、云南省等地，福建省野生鉤吻資源豐富[10]。為保證閩產鉤吻資源的可持續性利用，對閩產鉤吻進行分布和生境的調查，比較人工栽培不同年限鉤吻中鉤吻素子的含量，為鉤吻藥材生產質量管理規范(good agriculturing practice,GAP)的建設提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材樣品2015年4-10月采于閩侯、永定、云霄和尤溪，并經筆者鑒定為馬錢科胡蔓藤屬植物鉤吻。將不同產地的鉤吻藥材根、莖和葉分別收集干燥，粉碎，過3號篩，備用。

1.1.2藥品及試劑鉤吻素子對照品為本課題組前期提取分離精制而成，經高效液相色譜法鑒定，純度為99.1%。甲醇(色譜純)及氯仿、95%乙醇、氨水(均為分析純)(中國國藥集團化學試劑)；水為娃哈哈純凈水。

1.1.3儀器超聲波清洗器(KQ-500E型，昆山市超聲儀器有限公司)，高效液相色譜儀(1100LC型，美國Agilent公司)，電子天平(AR124CN型，奧豪斯儀器有限公司)，旋轉蒸發器(RE5299，鞏義市予華儀器有限責任公司)。

1.2方法

1.2.1鉤吻資源分布調查方法(1)文獻檢索調查：收集有關鉤吻的調查研究資料，了解閩產鉤吻的分布情況。(2)實地調查：咨詢相關方面專家、當地向導，查看鉤吻標本的采集記錄，確定調查地點和范圍，記錄鉤吻的生境。

1.2.2鉤吻素子含量測定

1.2.2.1色譜條件與系統適應性試驗按照高效液相色譜法(《中華人民共和國藥典一部》2010版附錄ⅥD)測定。檢測波長：256 nm；色譜柱：Phenomenex Kinetex EVO，250 mm×4.6 mm；流動相：甲醇-水-氨水(55∶45∶0.05)，流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。理論板數按鉤吻素子峰計算不低于5 000。對照品、鉤吻樣品及空白溶液的色譜圖見圖1。

1.2.2.2對照品溶液的制備精密稱取鉤吻素子對照品適量，加甲醇制成0.400 0 g/L的溶液，搖勻即得。

1.2.2.3空白溶液的制備取0.8 mL的3% NaOH于表面皿中，過夜陰干，加20 mL氯仿，置具塞錐形瓶中，超聲提取20 min(功率250 W，頻率50 kHz，溫度50 ℃)，重復3次，合并提取液，抽濾，濾液旋蒸至干，殘渣用甲醇溶解并轉移到10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得空白溶液。同樣條件下進行檢測，與對照品比較，無溶劑干擾峰。

1.2.2.4供試品溶液的制備取藥材粉末(過3號篩)，60 ℃干燥4 h，精密稱取0.300 0 g，用0.8 mL 3% NaOH潤濕，過夜陰干，置具塞錐形瓶中，加20 mL氯仿，超聲提取20 min(功率250 W，頻率50 kHz，溫度50 ℃)，重復3次，合并提取液，抽濾，濾液旋蒸至干，殘渣用甲醇溶解并轉移到10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，搖勻，濾過，即得。

1.2.2.5線性關系考察精密吸取對照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，分別取10 μL注入高效液相色譜儀測定。以峰面積為縱坐標，對照品質量濃度(μg/mL)為橫坐標作標準曲線，得回歸方程Y=10 932X+759，r=0.999 4，線性范圍為0.02～0.32 mg/mL(n=6)。

1.2.3超聲波提取鉤吻素子最佳工藝選擇分別采用甲醇、95%乙醇和氯仿超聲提取，按1.2.2的方法測定鉤吻素子的含量，比較鉤吻素子提取率，得適宜提取劑。為確定鉤吻素子的最佳提取工藝，以鉤吻素子的含量為考察指標，采用正交試驗法，以超聲提取時間、提取溫度、提取功率和料液比設計L9(34)4因素3個水平正交表(表1)。

表1　正交試驗因素與水平考察

2　結　果

2.1閩產鉤吻資源分布文獻資料顯示，閩產鉤吻主要分布在云霄、平和、上杭、永定、連城、永春、仙游、同安、閩侯、霞浦、福安等地。依據文獻的記載及當地向導的指引選定9個地方作為鉤吻生境考察點(表2)。閩產鉤吻野生資源主要集中分布于23°84′N～26°92′N、116°36′E～120°05′E、海拔800 m以下光照充足的山地路邊或山坡灌木叢中，喜生活在腐殖質或黃壤地帶。云霄、上杭、永泰、尤溪鉤吻分布較多，長勢旺盛，直徑>3 cm的植株較常見，多呈片狀分布。龍巖、寧德一帶有人為采挖的破壞現象，儲量較以前減少。在調查野生資源過程中，發現有人工栽培鉤吻，種植于大田和山坡，目前人工種植株約7萬～8萬株。

2.2超聲提取鉤吻素子的工藝優化

2.2.1提取溶劑的選擇同一超聲條件下，氯仿對于鉤吻素子的提取率最高，因此選擇氯仿作為提取劑(圖2)。

2.2.2正交試驗設計鉤吻素子最佳提取工藝正交試驗結果顯示，極差R的大小順序為C>D>B>A，即影響鉤吻素子超聲提取因素的主次關系依次為提取功率>提取時間>提取溫度>料液比。4個因素中提取功率的影響最大，料液比的影響最小。超聲法從鉤吻中提取鉤吻素子的最佳工藝條件為C2D2B2A2，即提取功率250 W、時間20 min、溫度50 ℃、料液比1∶20(表3)。

表2　閩產鉤吻野生生境狀況

2.3不同產地鉤吻素子含量的測定測量4個產地鉤吻中鉤吻素子的含量顯示，鉤吻根中的含量最高，平均為0.40%；莖中的含量居中，平均為0.24%；葉子的含量最低，平均為0.03%(表4)。

2.4人工栽培株鉤吻素子含量的測定人工栽培鉤吻有1年生的種苗和分別種植于大田、山坡的同批3年生植株。1年生鉤吻種苗干燥根質量僅為1.605 g，莖為3.747 g，種苗根、莖中鉤吻素子的總量分別為3.691，4.871 mg。經過3年的種植，3年生種植于大田和山坡的鉤吻根、莖的干質量和鉤吻素子含量均比1年生增加，山坡種植鉤吻根、莖的干質量增加到18.738，51.375 g，莖中鉤吻素子的總量高達87.338 mg，比1年生的種苗莖中的總量增加了17倍。3年生大田種植株莖的干質量為43.470 g，鉤吻素子的含量為0.15%，干質量和含量均略低于3年生山坡種植株(表5)。

表3　正交試驗結果

表4　不同產地同一植株根、莖和葉中鉤吻素子的含量

表5　1年生和3年生藥材鉤吻素子的含量

3　討　論

福建省野生鉤吻資源主要集中分布于23°84′N～26°92′N、116°36′E～120°05′E、海拔800 m以下光照良好的山坡、路旁，呈點狀或片狀分布。腐殖質土壤土層深厚，有機營養高，有利于鉤吻的生長。由于鉤吻可用于治療魚病和豬復壯[11]，野生鉤吻常被連根采挖，有些地區如龍巖上杭、永定，資源受到較大的破壞；閩東南地區在山坡開墾種植果園時常將鉤吻除去，致使閩產鉤吻的分布范圍縮小，產量下降。為滿足日益擴大獸藥的需求，閩西地區有小面積的人工種植鉤吻。

人工種植1年生鉤吻根中鉤吻素子的含量已高于0.2%、莖中的鉤吻素子含量也高于0.1%，但由于植株較小、質量輕，鉤吻素子的總量較低；隨著生長年限的增加，鉤吻根、莖的質量增加，3年生山坡種植株莖中鉤吻素子的總量高達87.338 mg，比1年生植株莖的含量增加了17倍，鉤吻素子的含量呈上升趨勢。但由于目前人工栽培的年限較短，僅有1年生和3年生的藥材，無法獲得栽培時間更長的樣品，鉤吻素子在鉤吻體內的累積趨勢暫時無法獲知，需進一步跟蹤研究。比較了同批分別種植于山坡和大田的植株，山坡種植株根、莖的干質量以及鉤吻素子的含量均高于大田種植株，原因可能是鉤吻為蔓生性藤本植物，山坡種植株間距較寬，且排水優于大田，生境更接近于鉤吻的野生狀態，因此產量和含量要優于大田栽培株。建議鉤吻的人工種植選地為向陽山坡、株距稍寬為宜。

超聲提取法相對于傳統的熱回流等方法具有簡單、時間短、提取率高等特點，是天然藥物提取的一個發展趨勢。陳志惠等在超聲提取鉤吻總堿時設置提取溫度為70 ℃，由于氯仿的沸點為61 ℃，在實際操作中，用70 ℃氯仿超聲提取較困難，所以在提取溫度的水平上設置最高溫度為60 ℃。用超聲提取對不同產地的鉤吻根、莖和葉的鉤吻素子含量測定表明，閩產鉤吻的根、莖和葉中均含有鉤吻素子，這與陳衛琳等報道閩產鉤吻葉中不含鉤吻素子不符[12]。鉤吻素子在鉤吻根中的含量最高，莖次之，葉子的含量最低。以云霄產鉤吻為例，根、莖、葉子中的含量分別為0.38%，0.21%，0.03%；根、莖中鉤吻素子的含量均比葉子高出7倍以上。鑒于葉子鉤吻素子含量低、采收困難及含大量葉綠素不利于提純等因素，鉤吻的入藥部位以根和莖為佳。

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(編輯:何佳鳳)

Geographical Distribution of Gelsemium elegans in Fujian Province and the Medicinal Value of the Parts of the Plant

SHI Dongmei1, SU Yanping2, WU Hongxia3, YU Changxi4

1. Department of Natural Medicine; 2. Department of Pharmacochemistry; 3. Experiment Center； 4. Department of Pharmacology,College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China

ObjectiveTo investigate the distribution ofGelsemiumelegansin Fujian province and assay the content of koumine from different parts ofGelsemiumelegansto determine the optimal medicinal parts.

MethodsLiterature research and field survey were both done to investigate the distribution; The ultrasonic extraction conditions of koumine were optimized by orthogonal test.HPLC analysis was performed to assay the content of koumine from roots, stems and leaves ofGelsemiumelegans.ResultsIn 23 84′N to 26 92′N and 116 36′E to 120 05′E were the main production areas ofGelsemiumelegansin Fujian province.Vertical level was under 800 m.The optimum ultrasonic extraction conditions were as follows: 250 W ultrasonic power, 20 min ultrasonic time, 50 ℃ temperature and 1∶20 solid-liquid ratio.The contents of koumine from roots and stems were higher than leaves.ConclusionFujian province has widespread distribution and rich amount of resource ofGelsemiumelegans.Medicinal parts ofGelsemiumelegansare roots and stems.

Fujian；Gelsemiumelegans; distribution; high pressure liquid chromatography; medicament portions

2016-01-13

福建省教育廳產學研項目(JA14132)

福建醫科大學 藥學院，福州3501081. 天然藥物學系；2. 藥物化學系；3. 實驗中心；4. 藥理學系

石冬梅(1975-)，女，講師，理學碩士

俞昌喜. Email: changxiyu@fjmu.edu.cn

R931.71; R282.71; R284.1

A

1672-4194(2016)03-0159-05