體外釋放酶免疫技術檢測結核分枝桿菌的臨床應用

汪金云，周東枝，徐亞麗

體外釋放酶免疫技術檢測結核分枝桿菌的臨床應用

汪金云，周東枝，徐亞麗

目的 評價體外釋放酶免疫技術在檢測結核分枝桿菌中的臨床應用。方法 選擇臨床病例201例包括肺內結核81例、肺外結核25例、不明原因發熱95例（其中45例為肺結核），另選健康人群30例，采用體外釋放酶免疫技術（TB-IGRA）、膠體金法（TB-Ab）、痰涂片抗酸染色鏡檢及聚合酶鏈式反應（TB-PCR）檢測。結果 TBIGRA檢測肺內結核組、肺外結核組以及不明原因發熱組的陽性率明顯高于其他檢測組，4種檢測方法在肺內結核組、肺外結核組、不明原因發熱組與健康對照組間差異均有統計學意義（均＜0.05）；TB-IGRA、TB-AB、痰涂片鏡檢、TB-PCR的靈敏度分別為91.4%、43.1%、30.9%、23.8%，特異度分別為91.3%、90.0%、98.7%、97.5%；126例肺結核患者中，痰涂片39例陽性和87例陰性，TB-IGRA檢測陽性率分別為92.3%、83.9%，兩者差異有統計學意義（＜0.05）。結論 TB-IGRA有更好的優越性和臨床應用，可推廣用于臨床。

結核分枝桿菌；體外釋放酶聯免疫法；-干擾素

結核病是由結核分枝桿菌所致以呼吸系統感染為主的慢性傳染病，是造成人類死亡最多的疾病之一。據統計我國結核病年發病100萬，發病率78/10萬，全國現有活動性肺結核患者499萬，患病率119/10萬，結核病年死亡人數5.4萬，死亡率4.1/10萬[1]。所以早期診斷和合理用藥對結核病患者尤為重要。目前臨床普遍采用的結核病診斷主要依賴于臨床癥狀、影像學特征和病原學診斷。至今沒有一種準確、快速、可靠檢測結核分枝桿菌的方法[2]。本文比較幾種實驗室檢測結核分支桿菌感染的方法，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集浙江省寧?？h第一醫院2013年1月至2014年4月收治的結核分枝桿菌疑似病例201例，其中男135例，女66例；年齡16～65歲；經臨床確診肺內結核81例，肺外結核25例，不明原因發熱就診病例95例。另選本院健康體檢職工30例，設為健康對照組，其中男16例，女14例；年齡25～55歲。

1.2 儀器和設備 北京萬泰生物有限公司體外釋放酶免疫技術（TB-IGRA）試劑盒；杭州艾博生物有限公司膠體金法（TB-Ab）試劑盒；中山大學達安生物有限公司聚合酶鏈式反應（TB-PCR）試劑盒；上?？迫AKHB ST-360酶標儀；美國ABI PRISM 7000型熒光定量基因擴增分析儀；德國徠卡DM500普通光學顯微鏡、離心機、水浴箱等。

1.3 方法 空腹采集靜脈血5 ml，一管肝素鋰抗凝管和一管生化管，分別用TBIGRA和TB-Ab；再采集2份痰標本分別用于痰涂片抗酸染色鏡檢和TB-PCR，標本采集嚴格按照實驗室標本采集規范要求。TB-IGRA采用體外釋放酶免疫技術檢測結核分枝桿菌，采集靜脈血分3 管24 h培養，再應用酶聯免疫吸附技術（Elisa）檢測，間接判斷結核分枝桿菌的感染，具體操作方法和結果判斷嚴格按照試劑盒說明書。TB-AB用膠體金技術檢測血清結核抗體，具體操作方法和結果判斷嚴格按照試劑盒說明書；痰涂片用抗酸染色鏡檢找抗酸分枝桿菌，由資深專業人員進行檢測；TB-PCR用PCR體外擴增技術檢測痰標本中結核分枝桿菌DNA，具體操作方法和結果判斷嚴格按照試劑盒說明書。

1.4 統計方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行處理，計數資料比較采用2檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同對象組 4種檢測方法的檢測結果 TB-IGRA檢測肺內結核、肺外結核、不明原因發熱陽性率明顯高于其他檢測方法（均＜0.05），其中肺外結核組痰涂片和 TB-PCR由于未收集到標本，未檢測。見表1。

表1 不同對象組4種檢測方法的檢測結果 例（%）

2.2 95例不明原因發熱4種檢測方法檢測結果 不明原因發熱95例患者經臨床確診為肺結核45例，非結核桿菌感染50例。肺結核組TB-IGRA檢測方法陽性率明顯高于其他3種方法（＜0.05），而非結核組4種檢測方法間差異無統計學意義（＞0.05）。見表2。

表2 不明原因發熱95例4種檢測方法檢測結果 例（%）

2.3 不同方法的靈敏度和特異度比較TB-IGRA靈敏度明顯高于其他3種方法，4種方法特異度相差不大。見表3。

表3 4種方法的靈敏度和特異度 %

2.4 痰涂片陽性與陰性肺結核患者TBIGRA結果比較 在126例肺結核患者中，痰涂片結核桿菌39例陽性同時用TB-IGRA檢測36例陽性（92.3%），而痰涂片87例陰性同時用TB-IGRA檢測73例陰性（83.9%），兩者差異有統計學意義（2=80.2，＜0.05）。

3 討論

目前結核分枝桿菌感染實驗室檢測主要依賴病原體檢測，隨著免疫學技術快速發展，體外釋放酶聯免疫法是利用致病性結核分枝桿菌特有而卡介苗、其他分枝桿菌缺失的開放讀碼框區域 1 （RD1）基因編碼的早期分泌靶向抗原6-kD（ESAT-6）和培養濾過蛋白 10kD （CFP10）肽段庫為抗原刺激全血標本中結核抗原特異性T細胞產生免疫應答，誘發結核感染T細胞分泌 -干擾素，再通過 ELESA方法檢測計算 -干擾素的含量，間接判斷結核分枝桿菌感染狀況。本文結果顯示，TB-IGRA在肺內和肺外結核陽性率和靈敏度，明顯高于其他3種方法，其對診斷肺結核肺外結核具有較高的敏感性和準確性。通過檢測 -干擾素含量可以判斷患者病程進展和體內細菌含量，還可以作為病情治療療效的一個指標，這已在Prabhu Anand[3]及方顏敏等[4]的實驗著作中得到了證實。特別在對一些不明原因發熱的患者 TB-IGRA陽性率也明顯高于其他3種方法，可以用于一些不明原因發熱患者的早期篩查，如果TB-IGRA結果陽性，可進一步有針對性檢查，提高結核菌檢測的陽性率。對痰涂片39例陽性和87例陰性肺結核患者TB-IGRA的陽性率差異有統計學意義（＜0.05），說明TB-IGRA也可用于痰涂片陰性結核病的診斷。而血清結核抗體靈敏度只有43.1%，血清結核抗體檢測主要以分枝桿菌外膜抗原為包被抗原，其他分枝桿菌感染也呈陽性，這樣給檢測帶來干擾。

病原體檢測是診斷結核分枝桿菌感染的“金標準”，但是其陽性率普遍都較低，文獻報道痰涂片和痰細菌培養的陽性率約為40%[5]。本文痰涂片鏡檢和TBPCR在肺內結核陽性率也是只有32.1%、24.7%，靈敏度為30.9%、23.8%，和文獻報道相差不大。病原體的檢測標本采集十分重要，不合格標本大大降低其陽性率，鏡檢、痰培養、TB-PCR檢測對人員和環境要求較高，且檢測耗時長。綜上所述，病原體檢測是診斷結核分枝桿菌感染的“金標準”，但檢出率低，血清結核抗體檢測陽性率也不高且干擾大。

而TB-IGRA作為結核桿菌感染診斷有效方法，特別是早期不明原因發熱臨床癥狀不明顯，可用其作早期篩查指標，且檢測耗時短，便于操作，可用于臨床。

[1] 2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查[J].中國防癆雜志,2012,8(34): 485-508.

[2] Garg SK,Tiwari D.Diagnosis of act ive tubercul osis:availablet echnologies,limit at ions,an d pos sibilities[J].J Clin Lab Anal,2003,17:155-163.

[3] Prabhu Anand S,Harishankar M,Salvaraj P,et al.Interferon gammagne+874 APT polymorphism and intercellular interferon gamma expression in pulmonary tubercul-osis[J].Cytokine,2010,49(2):130-133.

[4] 方顏敏,馬志明,柯橋,等.肺結核病灶組織中C-干擾素的表達及其臨床意義[J].實用醫學雜志,2010,26(13):2328-2330.

[5] Drobniewski FA,Caws M,Gibson A,et al.Modern laboratory diagnosis of tuberculosis[J].Lancet Infect Dis,2003,3(3): 141-147.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.016

R446.5

A

1671-0800(2016)01-0032-02

2015-08-10（本文編輯：孫海兒）

315600浙江省寧海，寧?？h第一醫院

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