TGF-/Smad傳導通路與慢性移植性腎腎病相關性研究

2016-09-19 07:35:36祁洪剛陳亮亮李毛毛姚許平翁國斌

現代實用醫學 2016年1期

關鍵詞：信號

祁洪剛，陳亮亮，李毛毛，姚許平，翁國斌

目前慢性移植腎腎病（CAN）被認為是在組織學上表現為移植腎病理慢性損傷，即CAN僅特指移植腎出現缺血性腎小球病（腎小球硬化）、動脈血管纖維性內膜增厚、腎小管萎縮及腎間質纖維化等主要的組織病理學特征，而沒有其他特殊疾病。CAN僅僅代表了移植腎功能不全的最終結局，它既不是一種疾病，也不是病因診斷，而是導致移植后期腎功能喪失的主要原因[1]。目前CAN的發病機制還未闡明，轉化生長因子（TGF-）在CAN發病中作為最關鍵的促纖維化細胞因子的作用目前還未研究清楚，但其在CAN發病機制中的作用不容忽視，近年國內外研究顯示TGF-高表達水平與CAN纖維化表現進程密切相關，經證實CAN纖維化進程與TGF-高表達有關。Smad蛋白是TGF-下游信號的重要轉導分子，介導了TGF-的胞內信號轉導。本文對TGF-/Smad信號通路在CAN發病中的作用和最新研究進展作一綜述。

1 TGF-和Smad蛋白

1.1 TGF-分子結構及其受體轉化生長因子 (TGF-)是轉化生長因子超家族成員之一，其分布于多種組織細胞內，屬于一種多功能的細胞調節蛋白，哺乳動物組織中TGF-存在3種亞單位，分別是TGF-1，TGF-2及TGF-3。它們由不同的染色體編碼而成，由不同的細胞分泌和表達，其分布具有一定的組織特異性。TGF-1在腎臟組織表達最多，且主要存在于腎小管上皮和腎小球，在哺乳動物的發育和機體功能平衡方面發揮重要作用。TGF-與受體的結合是TGF-/Smad信號轉導的第一步，TGF-受體有5型，其中參與該信號轉導的主要有I型和Ⅱ型受體，屬絲/蘇氨酸激酶受體家族，它由胞外區、跨膜區及含絲-蘇氨酸激酶結構的胞質3部分組成，其中I、II型受體與細胞內信號轉導有關，III型受體分膜結合型和游離型，前者無信號傳遞活性，但能增加II型受體與TGF-的親和力，后者結合后阻止TGF-與靶位點的結合，從而干擾了TGF-的生物活性，Ⅳ型、V型受體的作用目前尚不清楚。TGF-1型受體活化是 TGF-信號轉導的起點和關鍵步驟，而Smad蛋白是目前所知的惟一的TGF-受體的胞內激酶底物。

1.2 Smad蛋白的結構、分類與功能Smad是一種分子量為42～60kD的蛋白質，其在蛋白質分子的N端和C端有兩個結構域：分別為MH1和MH2區，其間有富含脯氨酸的間隔區，在無活性狀態下，MH1和MH2相互接觸，使其形成無活性構象，Smad家族蛋白是參與TGF-在細胞內信號轉導的一種重要細胞因子。目前哺乳類動物中發現的Smad蛋白有9種，分別用Smad l～9表示[2]。根據Smad蛋白家族結構和功能的特點，其可分為3類：（1）受體調節型Smads蛋白（R-Smads）包括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8。（2）共同調節型Smads蛋白（Co-Smads），即Smad4。（3）抑制性型Smads蛋白（anti-Smads），包括Smad6和Smad7。其中Smad2、3、4、7蛋白參與TGF-/Smad信號轉導過程，Smad2、3主要參與TGF-信號轉導，Smad4是TGF-信號轉導過程中共同需要的介質，Smad6、7可與TGF-I型受體結合，結合反應的穩定性比R-Smad更強，從而限制R-Smad被磷酸化，抑制TGF-信號通路[3]。Smad蛋白在其功能上表現的十分復雜。同一類Smad蛋白其功能也并非是完全相同的，即使同一種Smad蛋白，其在不同細胞或不同微環境下其作用也不同的。這種復雜性導致TGF-功能的多樣性。Smad蛋白結合于靶基因啟動子特定區域Smad蛋白轉錄復合物調節轉錄活性是通過直接招募轉錄合作激活因子或抑制因子而得以實現的[4]。除此之外，還存在另外一些調節方式，如Smad蛋白與DNA結合因子合作調節自身基因的表達和Smad蛋白直接與激活因子或者抑制因子作用等[5]。Smad蛋白可以通過廣泛地與輔助激活因子相互作用，將各種激活信號進行整合。白細胞抑制因子（LIF）通過與骨形態發生蛋白-2（BMP2）協作誘導星形膠質細胞分化過程，刺激結合于它們信號通路下游 P300不同部位的信號傳導與轉錄激活因子-3（STAT3）和Smadl，于整合信號后誘導膠質纖維酸性蛋白基因啟動子激活來獲得實現[6]。TGF-通過Smad蛋白所介導的胞內信號轉導可增加P15和P21的轉錄，這些蛋白與細胞周期蛋白或細胞周期蛋白依賴性激酶相結合并使之失活，使細胞周期停滯在G期，并誘導細胞凋亡。所以TGF-信號通路發生缺陷將導致腫瘤發生。

2 TGF-/Smad信號通路的路徑

TGF-受體復合物活化后促進Smad蛋白磷酸化是 TGF-/Smad信號轉導通路中最為關鍵的一步，與Smad蛋白信號傳導有關的TGF-超家族成員有TGF-1和TGF-Ⅱ兩種受體，這兩種受體均有絲/蘇氨酸激酶活性，TGF-信號轉導由 TGF-配體首先與細胞表面的TGF-Ⅱ型受體結合，形成復合物，再激活TGF-I型受體的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，形成異源三聚體，磷酸化的TGF-受體I（TBRI）可結合并磷酸化R-Smad （Smad2和 Smad3），從而解除了 RSmads蛋白N端MH1區和C端MH2的相互抑制作用，與I型受體分離，激活Smad2和Smad3蛋白才與Smad4結合形成活性的異聚體轉錄復合物，轉位進入細胞核，這樣才將信號從胞質轉導到細胞核，磷酸化的R-Smad和Smad4復合物入核后并和其他的核協同或抑制因子結合后以不同方式調節轉錄活動[7]。在TGF-/Smad信號轉導通路機制的調控下，TGF-1主要是通過其下游因子Smad2、3、7等參與纖維化的信號轉導過程。Smad蛋白是TGF-受體的胞內激酶底物，當R-Smad（Smad2、Smad3）表達增高，對纖維化的信號轉導過程起到正調節作用；而I-Smad（Smad7）表達增高，則起到負性調節作用；除此之外，上述復合物還可以通過激活細胞核內細胞外基質（ECM）成分如各型膠原、纖維粘連蛋白等啟動子的活性，從而增加ECM合成并沉積[8]。I-Smad（Smad7）可以通過兩種不同途徑發揮其負性調節作用：一方面是可競爭性的與 TGF-I型受體結合，抑制R-Smads（Smad2、Smad3）磷酸化，阻止受體復合物的形成及轉核入位，從而對TGF-信號轉導通路起到負反饋調節作用；另一方面是通過與Smad泛素化調節因子（sumrf）結合，smurf是一種泛素連接酶，包括smurfl、smurf2等，smurfl、smurf2結合 I-Smads的能力比結合 RSmads強得多[9]，Smad7可通過與smurf2結合使其變構激活，激活了的smurf2通過泛素化降解TGF-受體[10]，從而達到對TGF-通路的負反饋抑制作用。

3 TGF-/Smad信號通路與CAN相關性

CAN的病因可分為免疫性和非免疫性因素兩大類。其中免疫因素如移植物急、慢性排斥反應及人類白細胞抗原（HLA）配型不合等；非免疫因素如供受者在性別、年齡、體重、身高等相關因素不匹配，缺血再灌注損傷、高血壓、高血脂、高血糖、免疫抑制劑的腎臟毒性作用和巨細胞病毒感染等。同種異體腎移植后，機體為了修復損傷，移植物的內皮和上皮細胞就會產生TGF-和結締組織生長因子（CTGF）等，通過這些細胞因子來修復損傷。體外實驗或動物模型實驗表明幾乎導致CAN發生發展的所有危險因素都能影響 TGF-的表達，這表明TGF-在 CAN的形成和發展中起到非常重要的作用。

3.1 腎移植排斥反應對TGF-/Smad信號通路的影響在CAN的各種危險因素中機體持續的免疫應答狀態是導致移植物失敗的主要原因。在腎移植后機體發生急、慢性排斥反應時，機體內TGF-表達均明顯高于正常人。急性排斥反應時，TGF-主要在腎小管間質區內表達，而慢性時則主要在腎小管間質和腎小球細胞內表達。發生急性排斥反應時腎小管間質區的TGF-及其受體的表達水平均明顯增加，而發生慢性排斥反應時，在移植腎的皮質區內TGF-及基質蛋白則會過度表達。有研究發現，進行過同種異體腎移植的患者，如果對腫瘤壞死因子表現為遺傳性的高反應性狀態時，那么該患者也將處于急性排異反應的高危險狀態[11]。在對上述移植患者進行TCF-基因型的分析后發現，該患者倘若同時也是遺傳性的高 TGF-表達者，那么其發生急性排異反應的危險性將增加4倍以上，而發生可的松抗性的急性排異反應的危險性也將明顯增加。如果移植腎供體同樣也是高TGF-表達者，那么其發生急性排異反應和可的松抗性排異反應的危險性會更高[11]。研究者對100例腎移植患者進行了長達5年的跟蹤隨訪，發現腎移植患者中有9例發生 CAN。檢查發現這9例患者均為TGF-高表達者。而且，在這9例患者的供體中，有8例供體也同樣是高TGF-表達者[11]。有關研究顯示有高TGF-表達的腎移植患者，不管其TGF-來自腎移植物本身或浸潤的受體細胞內，發現其都與患者發生CAN有關。同樣的慢性排斥反應結果也出現在心、肺等器官移植患者[12-13]。

3.2 免疫抑制藥物對TGF-/Smad信號通路的影響 TGF-在多細胞動物的發育和體內功能平衡方面發揮著重要的作用，TGF-1在機體內有促進和抑制細胞增殖生長的雙重生物學作用。小劑量的TGF-1具有促使機體發生炎癥反應以及抑制體內淋巴細胞激活的作用，因此其對機體具有免疫抑制特性；在高濃度時，TGF-具有促進機體創傷愈合和纖維化過程。他導致纖維母細胞向創傷部位遷移，并且抑制機體內的膠原酶和其它金屬蛋白酶的活性，從而增加膠原產生，降低膠原降解，促進細胞基質大量沉積，最終引起移植器官纖維化及動脈粥樣硬化等[14-15]。因為TGF-1在機體內具有較強的免疫抑制作用，在器官移植術后前6個月內，機體內TGF-1的增加對移植物的生存是非常重要的，其能使移植物發生急性排斥反應的概率大大降低。近來研究也證實了TGF-1是環孢素腎毒性所致CAN的重要介質。環孢素可刺激機體TGF-1的合成與表達，引起細胞外基質沉積及纖維化過程[16]。在體外實驗中，雷帕霉素同樣可增加淋巴細胞和其它細胞株 TGF-的表達，Viklicky等[17]研究證實，在用Fisher和Lewis大鼠建立的CAN模型中，40-氧-2-羥乙基-雷帕霉素（SDZ-RAD）治療能明顯減少TGF-1、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和血小板源性生長因子（PDGF）基因表達,從而明顯減輕CAN病理進程。大量體內外實驗研究都已證明TGF-參與CAN的纖維化過程，介導成纖維細胞增生和基質蛋白合成。

3.3 TGF-/Smad信號通路在腎纖維化中的作用腎小球硬化和腎間質纖維化（腎臟纖維化）是各種原因所致腎疾病進展到終末期的共同病理表現,也是決定腎臟疾病進展的主要因素。雖然TGF-、自介素-a及、血小板衍生長因子（PDGF）和腫瘤壞死因子a（TNF-a）等多種細胞因子在機體內都具有致纖維化作用。但其中TGF-是最主要的一種致纖維化的細胞因子，其在腎小球硬化和腎間質纖維化形成的各個環節都起到非常重要的作用。Li等[18]通過動物實驗發現，在正常大鼠腎小管上皮細胞系（NRK52E）中，TGF-可隨著劑量的增加和時間延長會逐步誘導Smad2磷酸化。從而增加I、Ⅲ和Ⅳ型膠原的表達。使腎小管上皮細胞逐漸（TEC）向肌成纖維細胞（MFB）表型轉化。Lan等[19]研究發現，UU0模型大鼠與正常大鼠相比，其腎臟內Smad2和Smad3的表達升高6倍，并伴隨明顯的腎小管間質和腎小球的纖維化，而Smad7的表達則顯著降低，提示TGF-/Smad信號轉導通路具有促使組織器官發生纖維化的作用。

4 針對TGF-/Smad信號通路的CAN治療和展望

目前研究認為CAN與組織纖維化過程有著密切的關聯，TGF-/Smad信號通路在復雜的纖維化發病機制中發揮著中樞和主導作用，所以該通路在CAN的發病中具有重要作用，故可以通過控制該傳導通路的激活因素，阻斷該信號通路中的關鍵步驟，使其信號不能下傳以及上調負反饋調節機制等多方來面來延緩或阻止CAN的發生發展。在器官移植后發生的各種急慢性排斥反應中，研究發現其中Smads蛋白與TGF-的信號轉導關系密切，結合 Smads，尤其是Smad4，怎樣通過調節Smads對TGF-的水平進行調節，是今后研究的方向[20]。在各種動物模型中已經證實給予重組的TGF-l，會導致其腎小球硬化和腎間質纖維化，而給予其TGF-l拮抗劑則可阻止或改善纖維化進程。在嚙齒動物中，發現用腺病毒轉染 Smad7可阻止肺和腎纖維化的進展，這表明可以通過上調患者體內 Smad7的表達來延緩或阻止纖維化，這可能是將來一種治療纖維化的有效手段[21]。在器官移植領域,有關Smads在CAN中的研究才剛剛起步。鑒于TGF-在CAN中修復各種危險因素引起損傷中的重要調控作用，加強對Smads的研究，將有助于從細胞內信號轉導和基因表達調控水平闡明TGF-在CAN中作用的分子機制和CAN的發病機制，并為開辟防治慢性移植性腎腎病的新途徑提供理論和實驗依據。

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