高溫誘導(dǎo)人ECV304的凋亡及其信號(hào)傳導(dǎo)通路

朱曄晶，彭寧，凌杰，趙兵

高溫誘導(dǎo)人ECV304的凋亡及其信號(hào)傳導(dǎo)通路

朱曄晶，彭寧，凌杰，趙兵

目的 探討不同溫度對(duì)人ECV304凋亡的影響以及在凋亡過(guò)程中caspase家族所起的作用。方法 應(yīng)用MTT法、Hochest33342/pI熒光雙染、流式細(xì)胞術(shù)分析高溫對(duì)人ECV304細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的影響；比色法測(cè)定高溫誘導(dǎo)人ECV304凋亡過(guò)程中caspase-3、caspase-8、caspase-9活性變化。結(jié)果 39℃對(duì)細(xì)胞影響不明顯，41℃、43℃處理后細(xì)胞凋亡明顯增多，凋亡過(guò)程中，caspase-3活性與細(xì)胞凋亡率成正相關(guān)，caspase-8、caspase-9活性無(wú)明顯變化。結(jié)論 高溫對(duì)人ECV304有誘導(dǎo)凋亡作用，caspase-3在人ECV304凋亡過(guò)程中起重要作用。

細(xì)胞凋亡；熱處理；caspase活性；人ECV304

高熱環(huán)境對(duì)機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)均有不同程度的損害，極端熱環(huán)境可以導(dǎo)致某些蛋白結(jié)構(gòu)和功能改變，導(dǎo)致體能減弱甚至死亡[1]。高熱誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞損傷程度與熱的程度相關(guān)，極度高溫（49～50℃以上）可導(dǎo)致細(xì)胞在5 min內(nèi)以壞死方式死亡，而當(dāng)環(huán)境溫度在41.6～42℃時(shí)，細(xì)胞死亡方式以凋亡為主[2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體各個(gè)部位，研究發(fā)現(xiàn)，其是熱打擊時(shí)重要的反應(yīng)細(xì)胞，也是最早發(fā)生損傷的細(xì)胞[3]。研究也證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能損傷是引發(fā)多器官功能障礙綜合征等嚴(yán)重并發(fā)癥的重要因素[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究高熱對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，為高溫環(huán)境下作業(yè)人群健康體能的防護(hù)提供理論依據(jù)。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 主要儀器與細(xì)胞株 FormaSeriesⅡ隔水式CO2培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo公司；Nikon Eclipse TS100倒置顯微鏡來(lái)自日本Nikon公司；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human ECV304）由溫州醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑及耗材 RPMI1640培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶購(gòu)自Corning公司；Hoechst33342/PI細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒、caspase全酶抑制劑（Z-VADFMK）及3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）細(xì)胞毒性與增殖檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-488/PI凋亡檢測(cè)試劑盒為美國(guó) Invitrogen公司產(chǎn)品；caspase-3，caspase-8，caspase-9分光光度法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人ECV304細(xì)胞株培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 g/ml鏈霉素，100U/ml青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～3 d更換新鮮培養(yǎng)液。

1.3.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人ECV304細(xì)胞，接種于96孔板，4 h細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行熱處理，使其溫度分別為39℃、41℃、43℃，設(shè)加培養(yǎng)液對(duì)照組37℃，2 h后取出，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按MTT檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。用酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定各組細(xì)胞（6個(gè)孔）的A值，以此表示細(xì)胞的相對(duì)活力。

1.3.3 Hoechst33342/PI熒光雙染進(jìn)行細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察 人ECV304細(xì)胞按1×105/孔接種35 mm小培養(yǎng)皿，長(zhǎng)滿瓶底70%后改用無(wú)血清培養(yǎng)液孵育，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。作用2 h后，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按Hoechst33342/PI熒光染色試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行活細(xì)胞染色，使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)。正常細(xì)胞核Hoechst33342染色為淡藍(lán)色熒光，PI不染色；凋亡細(xì)胞核Hoechst33342染色為強(qiáng)亮藍(lán)色熒光，PI不染色；死亡細(xì)胞核Hoechst33342染色為強(qiáng)亮藍(lán)色熒光，PI染色呈紅色熒光。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡人ECV304細(xì)胞按5×105/孔接種6孔板，長(zhǎng)滿瓶底 90%后改用無(wú)血清培養(yǎng)液孵育，并進(jìn)行實(shí)組分組，按細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察處理分組。作用2 h后，分別收集不同處理組細(xì)胞，按AnnexinV-488/PI凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行處理。1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡細(xì)胞率。

1.3.5 分光光度法檢測(cè)caspase-3，caspase-8，caspase-9活性變化 收集 0、0.5、1、2、3、4 h對(duì)照組與43℃處理組細(xì)胞于50 l冷裂解緩沖液中，按照Caspase-3，caspase-8，caspase-9分光光度法檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。各處理樣品分別加樣至96孔培養(yǎng)板，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)A值，檢測(cè)波長(zhǎng)為405nm時(shí)caspase-3，caspase-8，caspase-9活性變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用 檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果 39℃熱處理對(duì)細(xì)胞活力幾乎無(wú)影響，其細(xì)胞存活率（[4.16±0.36）%]與對(duì)照組（[3.91±0.18）%]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（i=1.77，＞0.05），隨著熱處理溫度的升高41℃、43℃組其細(xì)胞存活率（[16.09± 0.40）%、（48.21±0.58）%]與對(duì)照組37℃差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（i=86.46、226.90，均＜0.05）。

2.2 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組細(xì)胞核均勻，Hoechst33342染色呈彌散均勻淡染熒光，PI不染色。39℃作用組經(jīng)Hoechst33342染色后可見(jiàn)大部分為正常細(xì)胞核，僅少量細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮，染色呈亮藍(lán)色熒光增強(qiáng)等凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變，其中PI染色細(xì)胞數(shù)極少。43℃作用組凋亡細(xì)胞比例較39℃作用組明顯增加，核為強(qiáng)藍(lán)色熒光染色，核邊緣呈明顯波紋狀或折縫狀改變，可見(jiàn)到染色質(zhì)聚集、邊緣化等凋亡早期典型形態(tài)學(xué)改變，PI不染色。43℃+40MZ-VAD-FMK組凋亡細(xì)胞比例較43℃作用組有所下降，細(xì)胞凋亡影響與39℃作用組較接近。見(jiàn)封三彩圖9。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 39℃作用組凋亡率高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（i=1.11，＞0.05）；41℃、43℃作用后凋亡率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（i=25.31、74.95，均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同溫度處理組對(duì)人ECV304細(xì)胞凋亡的影響（ =3）

2.4 熱處理誘導(dǎo)人ECV304凋亡過(guò)程中caspase-3，caspase-8，caspase-9活性變化caspase-3活性與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=32.63，＜0.05）；caspase-8，caspase-9活性變化不明顯，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.49、1.16，均＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 不同溫度對(duì)caspase-3、caspase-8、caspase-9活性的影響

3 討論

細(xì)胞凋亡不同于細(xì)胞壞死，是細(xì)胞在生理或病理情況下發(fā)生有序的主動(dòng)的非炎癥死亡，又稱程序性死亡，它不僅存在于生長(zhǎng)發(fā)育的一般生命過(guò)程，還廣泛參與了許多疾病的病理機(jī)制[5]。

血管內(nèi)皮系統(tǒng)能維持血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及各組織器官的功能，其內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或壞死改變能引起一系列繼發(fā)機(jī)體生理生長(zhǎng)功能改變，出現(xiàn)各種臨床癥狀[6]。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證高溫對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的傷害，從41℃開(kāi)始，隨著溫度的增高，細(xì)胞凋亡的數(shù)量也逐漸增多，尤其在持續(xù)高溫2～3 h時(shí)間段，凋亡率達(dá)到頂峰，顯示出溫度對(duì)其誘導(dǎo)作用具有依賴性；同時(shí)通過(guò)對(duì)人ECV304凋亡的檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)caspase全酶抑制劑對(duì)高溫造成的細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用，可在一定程度降低高溫對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)率，推測(cè)caspase在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)在熱處理人ECV304后，caspase-3隨著時(shí)間的增加其活性變化與細(xì)胞凋亡趨勢(shì)一致，說(shuō)明caspase-3可能參與了高溫誘導(dǎo)的人ECV304細(xì)胞凋亡；同時(shí)caspase-8和caspase-9活性變化不大，caspase-8和caspase-9在此次凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中的具體作用仍有待進(jìn)一步證實(shí)。由此證明血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是由caspase-3介導(dǎo)，caspase-8、caspase-9不參與或參與的較少。此次實(shí)驗(yàn)還顯示出caspase全酶抑制劑并沒(méi)有完全阻斷高溫誘導(dǎo)的人ECV304細(xì)胞的凋亡，提示高溫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷還可能涉及其他信號(hào)傳導(dǎo)通路，亦有研究顯示不依賴caspase的凋亡模式存在[7]，因此，其具體的細(xì)胞毒性機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)caspase-3在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用，為中暑的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為中暑與溫度之間的關(guān)聯(lián)提供了一些相關(guān)的實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.013

R594.1

A

1671-0800(2016)01-0025-03

2014-10-12（本文編輯：孫海兒）

318020浙江省臺(tái)州，臺(tái)州市第一人民醫(yī)院

朱曄晶，Email:hyzyj001@163.com