舍曲林對缺血性腦卒中后抑郁模型大鼠海馬TrkB和CREB表達的影響

鄭永麗，王昊亮，李文強，王旭生，宋景貴

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舍曲林對缺血性腦卒中后抑郁模型大鼠海馬TrkB和CREB表達的影響

鄭永麗，王昊亮，李文強，王旭生，宋景貴

目的觀察舍曲林對缺血性腦卒中后抑郁模型大鼠行為學的影響，以及該模型大鼠海馬酪氨酸激酶受體B(TrkB)和cAMP反應原件連接蛋白(CREB)表達的影響。方法將40只成年雄性SD大鼠隨機分為假手術組、抑郁組、PSD組和舍曲林預防組，每組10只。采用改良雙側頸總動脈結扎術制備全腦缺血大鼠模型，慢性不可預見性溫和刺激和孤養法制備抑郁大鼠模型，將以上方法相結合制備PSD大鼠模型。舍曲林預防組予舍曲林水溶液 [1 mg/(100g·d)]對制備的PSD大鼠每天灌胃1次。觀察各組大鼠自發性行為學改變，采用蔗糖水消耗試驗、曠場試驗、體重變化評定大鼠的行為學變化；21 d后采用免疫組織化學法分析大鼠海馬TrkB、CREB蛋白的表達。結果應激開始后第7 d、第14 d、第21 d測大鼠體重、蔗糖水飲用量、曠場試驗水平運動距離，PSD組較假手術組差異有統計學意義(P<0.01)，預防組較PSD組差異有統計學意義(P<0.01)。免疫組化結果顯示，PSD組大鼠模型海馬各區TrkB、CREB的平均光密度值均明顯低于假手術組(P<0.01，P<0.05)，舍曲林預防組大鼠模型海馬各區TrkB、CREB的平均光密度值明顯高于PSD組(P<0.01)。結論舍曲林可有效改善PSD大鼠的抑郁狀況，TrkB、CREB參與此過程并起著重要作用。

舍曲林；卒中后抑郁；酪氨酸激酶受體B；cAMP反應原件連接蛋白

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中患者最為常見的并發癥之一，主要表現為情緒低落、興趣下降和睡眠障礙等，其發病率占腦卒中患者的20%～79%，嚴重影響患者的生存質量和轉歸[1，2]。近年來研究發現BDNF-TrkB-CREB通路與卒中后抑郁發生有密切關系[3，4]。酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)為腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的受體之一，環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)為信號轉導通路一個關鍵的調節子，它們表達的變化有可能通過改變BDNF-TrkB-CREB通路從而影響PSD的發生。在對抗抑郁藥物作用機制方面的研究中，Mi等通過體外實驗證實各種選擇性5-HT再攝入抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)可通過調節突觸蛋白水平和海馬樹突的生長來調控突觸的可塑性；SSRIs是通過BDNF-TrkB-CREB通路來完成這一生理過程的[5]。舍曲林是SSRIs的經典代表藥物，具有高選擇性、高安全性等特點，被廣泛應用于臨床。本實驗通過建立缺血性腦卒中大鼠模型，應用舍曲林藥物預防治療，通過觀察大鼠行為學的改變以及海馬區TrkB、CREB的表達改變，探討舍曲林對缺血性腦卒中大鼠抑郁發生的影響并探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠40只，清潔級，雄性，體重(230.0±20.0)g，由鄭州大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。

1.2實驗儀器和試劑曠場箱(100 cm×100 cm×40 cm)(深圳市沃瑞德生命科技有限公司)；CM1850冰凍切片機(德國Leica)；DM2000圖像采集與分析系統(德國Leica)；舍曲林(天津華津制藥有限公司)；Rabbit Anti-CREB-1 antibody (bs-0035R)(北京博奧森生物技術有限公司)；Rabbit Anti-TrkB antibody (bs-0288R)(北京博奧森生物技術有限公司)；SP-9001兔SP檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；濃縮型DAB試劑盒(20×)(ZLI-9018)(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3分組首先進行蔗糖水消耗試驗和曠場實驗(open-field test，OFT)，并進行行為學評分。測出蔗糖水消耗試驗和OFT的基線值，從中篩選出得分均一的大鼠，隨機分為假手術組、抑郁組、PSD組及舍曲林預防組，每組10只。假手術組：對實驗大鼠行假手術，術后7 d每天進行生理鹽水灌胃21 d；抑郁組：對實驗大鼠行假手術，術后7 d行慢性不可預見性溫和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，參考Jindal等[6]方法并加以改進，同時每天進行生理鹽水灌胃21 d；PSD組：對實驗大鼠行改良雙側頸總動脈結扎術[7]，術后7 d行CUMS并同時每天進行生理鹽水灌胃21 d；舍曲林預防組：對實驗大鼠行改良雙側頸總動脈結扎術，術后7 d行CUMS并同時每天進行舍曲林水溶液[1 mg/(100g·d)]灌胃21 d。

1.4行為學觀察每天觀察各組大鼠的進食、飲水情況，大便狀況以及精神狀況，并在大鼠術前1 d、應激開始后7 d、14 d、21 d記錄各組大鼠的體重，并進行蔗糖水消耗試驗，記錄各組大鼠1 h的飲水量，并計算出各組大鼠蔗糖水飲用量(g/100 g)=1 h飲水量/動物體重×100；進行OFT記錄各組大鼠5 min內的水平運動距離。

1.5免疫組織化學方法檢測各組大鼠海馬區TrkB和CREB含量的測定在實驗最后一次行為學評估后，所有大鼠給予10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射進行麻醉，打開胸腔暴露心臟，灌注生理鹽水，待流出液體變為無色時換為4%多聚甲醛灌注，注意先快后慢，待大鼠四肢肌肉不停抽搐即可停止灌注。灌注后斷頭取腦，4%多聚甲醛固定過夜，再經蔗糖水溶液梯度脫水，OCT包埋劑包埋，-70 ℃冰凍保存，冰凍切片機-20 ℃進行切片，按照免疫組化SP-9001兔SP及縮型DAB試劑盒說明進行操作。免疫組化結束后，通過DM2000圖像采集與分析系統采集圖片，運用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定每張免疫組化圖片中海馬TrkB與CREB陽性染色的平均光密度值，取同一個腦組織3張圖片的平均值對其表達進行定量分析。

2　結　果

2.1各組大鼠體重變化與假手術組相比，PSD組和抑郁組大鼠體重增長速度緩慢，舍曲林預防組體重逐漸明顯增加(見表1)。

2.2各組大鼠蔗糖水飲用量變化與假手術組相比，PSD組和抑郁組大鼠蔗糖水飲用量明顯降低，舍曲林預防組大鼠蔗糖水飲用量逐漸增加(見表2)。

2.3OFT大鼠水平運動變化PSD組和抑郁組大鼠OFT的水平運動距離均明顯低于假手術組，舍曲林預防組大鼠OFT的水平運動距離明顯高于PSD組(見表3)。

2.4各組大鼠海馬各區TrkB蛋白的表達PSD組和抑郁組大鼠海馬各區TrkB的平均光密度值均低于假手術組，舍曲林預防組TrkB的平均光密度值高于PSD組(見表4)。

2.5各組大鼠海馬各區CREB蛋白的表達PSD組和抑郁組模型大鼠海馬各區CREB的平均光密度值均低于假手術組，舍曲林預防組CREB的平均光密度值均高于PSD組(見表5)。

表1　各組大鼠體重變化情況±s，g)

與假手術組相比aP<0.01，與假手術組相比bP<0.05，與PSD組相比cP<0.01

表2　各組大鼠蔗糖水飲用量情況

與假手術組相比aP<0.01；與PSD組相比bP<0.01

表3　OFT水平運動測定

與假手術組相比aP<0.01；與PSD組相比bP<0.01

表4　大鼠海馬各區TrkB陽性染色平均光密度值±s)

與假手術組相比aP<0.01，與PSD組相比bP<0.01

表5　大鼠海馬各區CREB陽性染色平均光密度值±s)

與假手術組相比aP<0.01，與假手術組相比bP<0.05，與PSD組相比cP<0.01

3　討　論

該實驗采用改良雙側頸總動脈結扎術建立全腦缺血大鼠模型[7]，并在此模型基礎上結合孤養法、CUMS[6]和舍曲林水溶液灌胃以模仿PSD的預防治療。本研究動態行為學評估顯示：通過舍曲林預防治療能夠有效改善大鼠的抑郁情緒、活動能力。舍曲林為選擇性5-HT再攝取抑制劑，有研究證明，抑郁的神經生物學變化主要為大腦5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素等遞質功能紊亂[8]，SSRIs即是通過阻斷5-HT的再攝取以提高突觸間隙5-HT濃度以起到抗抑郁作用。

在免疫組化結果分析中，PSD組海馬區的TrkB、CREB的光密度值明顯下降，這與相關研究結果較為一致[4，9，10]，舍曲林預防組海馬區TrkB、CREB的光密度值明顯提高，基本達到正常，可見TrkB、CREB含量的變化與抑郁行為的出現有一定的關聯。

近年來神經營養因子學說漸受到人們的重視，BDNF是一種腦內含量最豐富的神經營養因子[11]，通過增強突觸可塑性[12，13]、促進神經發生發揮神經保護作用，通過促進多巴胺能及5-羥色胺能神經元的生存發揮抗抑郁作用[14]。TrkB為BDNF的高親和力受體，已知神經營養因子要發揮作用，首先得與其受體結合，依次引起一系列的生化反應，啟動細胞內信號轉導途徑，CREB為信號轉導通路一個關鍵的調節子。它們表達的變化有可能通過改變BDNF-TrkB-CREB通路從而影響PSD的發生。

動物實驗研究發現向海馬內注入外源性BDNF可改善抑郁樣行為，且可增加海馬內TrkB和CREB的總量[15]。研究證實舍曲林上調大腦海馬BDNF[16]，且SSRIs最有可能通過增加神經營養因子如BDNF的表達刺激突觸可塑性和神經發生從而發揮抗抑郁作用[17]。因此，本實驗研究顯示經過21 d舍曲林預防治療后，PSD大鼠的抑郁樣行為和海馬區TrkB、CREB的含量水平都得以改善，可能是由于使用SSRI類代表藥物舍曲林作用于PSD大鼠，上調海馬BDNF的表達，能夠增長TrkB的水平，BDNF與TrkB特異性結合發揮生物學效應，如促進神經元修復與再生、并通過調節突觸的可塑性促進軸突之間的連接，與此同時激活CREB相關通路，CREB作為通路上重要的轉錄因子增強BDNF轉錄進一步預防PSD的發生。且有研究發現在應激抑郁大鼠的海馬中BDNF、TrkB、pCREB表達減少，通過激活5-HT1A受體，可以增加它們的表達，從而也減輕了抑郁癥狀[18]，有力支持了本實驗的研究推斷。

綜上所述，對缺血性腦卒中大鼠應用舍曲林可增加TrkB與CREB的表達從而有效預防PSD的發生，TrkB與CREB有可能參與抑郁癥狀的發生，參與PSD的藥物預防的生物學機制。

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Effects of sertraline on the expression of TrkB and CREB in ischemic post-stroke depression rats

ZHENGYongli，WANGHaoliang，LIWengqiang，etal.

(TheSecongAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity，Xinxiang453002，China)

ObjectiveTo observe the effects of sertraline on the behavior in ischemic post-stroke depression rats，and the expression of TrkB and CREB in hippocampus. Methods40 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，simple depression group，post-stroke depression (PSD) group and sertraline prevention group (n=10 each). The complete cerebral ischemic rat models were established with reformed occluding the bilateral carotid artery method；applying chronic unpredictable mild stimulation and isolation feed were used to make the rat depression model：the combination of the above methods were taken to induce rat PSD model；sertraline prevention models of rats were induced by subcutaneous gavaged with 1 mg/100(g. d) sertraline. The changes in spontaneous behavior of rats were observed，the changes of behavior in rats were evaluated by sucrose water consumption，open field test and weight changes，and the changes of tyrosine kinase receptor B (TrkB)，cAMP response element binding protein (CREB) of hippocampus were measured by immunohistochemistry after 21days. ResultsThe rat body weight，sucrose water consumption，open field test horizontal movement distance on the 7th，14th，21th were measured after CUMS，the PSD group compared with the control group，the differences had statistical significance (P<0.01)；the sertraline prevention group compared with the PSD group，the differences had statistical significance (P<0.01). The results of immunohistochemistry showed that the average optical density value of both the TrkB and CREB in the rat hippocampus each area of the PSD group decreased significantly compared with control group(P<0.01 orP<0.05)，and those of sertraline prevention group increased clearly compared with the PSD group(P<0.01). ConclusionSertraline may effectively improve PSD rat depression behavior，TrkB and CREB are involved in this process，and play an important role.

Sertraline；Post-stroke depression；Tyrosine kinase receptor B；cAMP response element binding protein

1003-2754(2016)07-0592-04

2016-01-10；

2016-04-30

國家自然科學基金項目(No. 81471349)

(新鄉醫學院第二附屬醫院，河南 新鄉 453002)

宋景貴，E-mail：songjg62@126.com

R743.3

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