硫酸鎂對大鼠局灶性腦缺血后氧化應激和NF-кB蛋白表達的影響

閔鶴鳴，賈玉潔，姜興千，包翠芬，閔連秋

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硫酸鎂對大鼠局灶性腦缺血后氧化應激和NF-кB蛋白表達的影響

閔鶴鳴1，賈玉潔2，姜興千2，包翠芬1，閔連秋2

目的探討硫酸鎂(MgSO4)對大鼠腦缺血后氧化應激和NF-кB蛋白表達的影響。方法60只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組及MgSO430 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg組。采用線栓法制備大鼠永久性大腦中動脈缺血模型(MCAO)。術后即刻假手術組與模型組腹腔注射生理鹽水1 ml，MgSO4各劑量組按上述劑量腹腔注射250 g/L MgSO4注射液(均用生理鹽水稀釋至1 ml)。24 h后檢測腦勻漿液中超氧化物岐化酶活性(SOD)、丙二醛(MDA)含量，應用免疫組化技術觀察NF-кB蛋白陽性細胞的表達。結果與模型組相比，MgSO460 mg/kg和MgSO4120 mg/kg兩組的SOD活性均顯著增高(P=0.000)，而MgSO430 mg/kg組沒有統計學意義；MgSO4各劑量組的MDA含量均顯著降低(P=0.000)；MgSO460 mg/kg組和MgSO4120 mg/kg組的NF-кB蛋白陽性細胞表達明顯減少(P=0.000)，而MgSO430 mg/kg組無統計學差異。與MgSO430 mg/kg組比較，MgSO4120 mg/kg組的SOD活性顯著增高(P=0.015)，而MgSO460 mg/kg組沒有統計學意義；MgSO460 mg/kg組和MgSO4120 mg/kg組的MDA含量顯著降低(P=0.001和P=0.000)；MgSO460 mg/kg組和MgSO4120 mg/kg兩組的NF-кB蛋白陽性細胞表達明顯減少，差異具有顯著性(P=0.000)。結論MgSO4對大鼠局灶性腦缺血后氧化應激損傷具有良好的保護作用，其機制可能與清除自由基、減輕氧化性損傷和抑制NF-кB蛋白的表達有關。

硫酸鎂；腦缺血；超氧化物岐化酶；丙二醛；NF-кB

腦血管病是嚴重威脅人類生命的三大主要死亡原因之一，有著很高的發病率、致殘率和病死率，其有效的治療方法相當缺乏，尋找新的治療方法是當今神經學科領域的熱點。溶栓治療是20世紀90年代治療缺血性疾病突破性進展。然而，由于溶栓治療的時窗很窄以及出血的并發癥，對于很多腦卒中患者來說有著極大的局限性；而神經保護治療是指保護腦實質組織或腦細胞，而非血管的再通，可以適應于各類腦血管病的治療。

有研究發現[1，2]，急性腦梗死患者血清中的鎂水平下降，應用鎂劑治療具有一定的臨床療效，且發現硫酸鎂(magnesium sulfate，MgSO4)的神經保護作用具有劑量依賴性；動物實驗研究亦發現[3，4]，MgSO4對大鼠腦缺血具有腦保護作用，但具體機制有待進一步研究。本實驗擬從氧化應激和NF-кB的角度探討MgSO4的神經保護作用機制，為其臨床應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1分組與給藥健康雄性SD大鼠60只，體質量(280±20) g，遼寧醫學院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(遼)2003-0007。隨機分為5組，每組12只，分為假手術組、模型組、MgSO4干預分別劑量30 mg/kg組、60 mg/kg組和120 mg/kg組。假手術組與模型組術后即刻腹腔注射生理鹽水1 ml，各治療劑量組按上述劑量腹腔注射250 g/L MgSO4注射液(均用生理鹽水稀釋至1 ml)，觀察24 h。

1.2藥品及試劑MgSO4由常州蘭陵制藥有限公司生產，批號：0402231；超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒皆由南京建成生物工程研究所提供；核因子(nuclear factor kappa B，NF-кB)檢測試劑盒購自武漢博士德生物制品公司。

1.3大鼠局灶性腦缺血模型的制備參照Longa[5]和Nagasawa[6]報道的方法加以改進制備大鼠大腦中動脈缺血模型，各組均于24 h后斷頭處死。采用100 g/L水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，頸正中切口長3.0 cm，分離暴露右側頸總動脈，結扎其近端。于頸總動脈近頸內、外動脈分叉處剪一小口。用頭端燒成光滑杵狀的國產尼龍線(直徑0.25～0.30 mm，長6 cm)作為栓線，并將制備好的栓線經外套管引導下插入，緩慢推送入頸內動脈，至有阻力時停止，栓線頭端入大腦前動脈近端，進線長度18～20 mm，使大腦中動脈供血受到阻斷，固定栓線。模型成功的標志是大鼠即刻出現右側Horner征，及清醒后出現左側前肢不同程度癱瘓[5]。假手術組僅分離動脈而不插入栓線，于觀察24 h、進行神經行為學評分后分別取腦制備檢測標本。

1.4腦組織勻漿SOD活性和MDA含量測定每組8只大鼠用于測定SOD活性和MDA含量，術后24 h予以20%烏拉坦(0.5 ml/100 g)麻醉，快速斷頭取腦。去除低位腦干及嗅束，用生理鹽水沖洗腦表面血液，濾紙吸干表面水分，剝除軟腦膜，取右側大腦半球。以重量(g)/體積(ml)比1：9加入0.9%的冰生理鹽水用超聲波細胞粉碎機制成勻漿，冷凍離心機離心，以4000 r/min離心15 min后取上清液，即制成100 g/L的腦組織勻漿，分別采用黃嘌呤氧化法、硫代巴比妥酸法和考馬斯亮藍蛋白測定法測定SOD活性、MDA和勻漿蛋白含量。嚴格按說明書操作。

1.5免疫組化檢測缺血區腦組織NF-κB蛋白表達每組4只大鼠用于測定NF-κB蛋白表達。將腦病理組織切片進行免疫組化SABC法染色，嚴格參照武漢博士德生物試劑公司說明書操作。每只大鼠取1張腦組織切片，顯微鏡下定位，取缺血側大腦的半暗帶區觀察，每張切片采集5個具有代表性的高倍視野，每組各20個視野。采用雙盲法計算每個高倍鏡(400倍)視野NF-кB陽性細胞個數。

2　結　果

2.1MgSO4對局灶性腦缺血大鼠腦SOD活性與MDA含量的影響5組大鼠腦組織的SOD活性測定見附表，經單因素方差分析，F=10.592，P=0.000，差別具有統計學意義。進一步分析發現，與假手術組比較，模型組和MgSO430 mg/kg組的SOD活性均顯著降低(P=0.000和P=0.004)，而MgSO460 mg/kg和MgSO4120 mg/kg兩組沒有統計學意義；與模型組比較，MgSO460 mg/kg和MgSO4120 mg/kg兩組的SOD活性均顯著增高(P=0.000)，而MgSO430mg/kg組沒有統計學意義；與MgSO430mg/kg組比較，MgSO4120 mg/kg組的SOD活性顯著增高(P=0.015)，而MgSO460mg/kg組沒有統計學意義。

5組大鼠腦組織的MDA含量測定見附表，經單因素方差分析，F=36.878，P=0.000，差別具有統計學意義。進一步分析發現，與假手術組比較，模型組和MgSO430 mg/kg組的MDA含量均顯著升高(P=0.000)，MgSO460mg/kg組亦升高(P=0.008)，而MgSO4120 mg/kg組沒有統計學意義；與模型組比較，MgSO4各劑量組的MDA含量均顯著降低(P=0.000)；與MgSO430 mg/kg組比較，MgSO460mg/kg組和MgSO4120 mg/kg組的MDA含量顯著降低(P=0.001和P=0.000)。

2.2MgSO4對局灶性腦缺血大鼠腦組織NF-кB蛋白表達的影響5組均有不同程度的NF-кB表達，但假手術組僅有極少數陽性細胞，其余4組梗死灶周圍的半暗區內可見較多的NF-кB陽性細胞，光鏡下胞核呈黃褐色，顆料狀，且蘇木素不能復染。

模型組可見大量的陽性表達細胞，細胞核內可見明顯的顆粒或團塊狀表達。經單因素方差分析，F=36.878，P=0.000，差別具有統計學意義。進一步分析發現，與假手術組相比，模型組、MgSO430 mg/kg組和MgSO460 mg/kg組的NF-кB蛋白陽性細胞表達明顯增加(P=0.000)，而MgSO4120 mg/kg組沒有統計學意義；與模型組比較，MgSO460 mg/kg組和MgSO4120 mg/kg組的NF-кB蛋白陽性細胞表達明顯減少(P=0.000)，而MgSO430 mg/kg組無統計學差異；與MgSO430 mg/kg組相比，MgSO460 mg/kg組和MgSO4120 mg/kg兩組差異具有顯著性(P=0.000)，(見表1)。

表1　MgSO4對局灶性腦缺血大鼠腦組織SOD活性、MDA含量和NF-кB蛋白表達的影響±s)

與假手術組比較▲▲P<0.01；與模型組比較★★P<0.01；與硫酸鎂30 mg/kg組比較#P<0.05，##P<0.01

A：假手術組NF-κB免疫組織化學染色 ×400

B：模型組NF-κB免疫組織化學染色×400

C：MgSO4 30 mg/kg組NF-κB免疫組織化學染色×400

D：MgSO4 60 mg/kg組NF-κB免疫組織化學染色×400

E：MgSO4 120 mg/kg組NF-κB免疫組織化學染色×400

3　討　論

腦缺血損傷是由多因素共同參與，其中能量代謝障礙、氧自由基、Ca2+超載等因素在腦缺血損傷中發揮關鍵作用。腦組織神經細胞對自由基損傷極其敏感，腦缺血時自由基的產生與內源性抗氧化系統失衡，自由基蓄積會引起腦組織損傷。SOD對機體的氧化與抗氧化之間發揮平衡作用，能清除超氧陰離子自由基，對細胞有保護作用，是主要的自由基清除酶，測定此酶可間接反映機體清除自由基的能力[7～9]；MDA是氧自由基與生物膜多聚不飽和脂肪酸作用生成的代謝產物，間接反映組織中氧自由基含量的變化與細胞損傷的程度[7]。我們在實驗研究中發現，MgSO4不僅可以降低腦組織中的MDA含量，而且還可以提高SOD活性，且呈劑量依賴關系。提示MgSO4對缺血腦組織的神經保護機制與其抗氧化應激作用有關。

NF-кB是1986年由Sen和Bal-timore[10，11]發現的，是一種能與DNA結合的二聚體蛋白。NF-кB參與多種炎癥介質及細胞因子的基因調控，與腦缺血后炎癥反應密切相關[12]。本研究表明在正常腦組織中NF-кB僅有少量表達，缺血后表達急劇升高，提示腦缺血后NF-кB被激活，NF-кB通路參與了缺血性腦損傷過程；與模型組相比較，MgSO4各劑量組腦組織中NF-кB蛋白的表達明顯較少，推測MgSO4可能通過下調NF-кB蛋白的過度表達來發揮神經保護作用的。

引起NF-кB激活的因素很多，紫外線、放射線、細菌、內毒素、病毒、細胞因子、氧自由基等均可誘導NF-кB的產生[13]。在腦缺血及缺血后再灌注期間集體可以產生大量的自由基與反應性氧物質(reactive oxygen species，ROS)，如脂質過氧化物、NO、過亞硝酸鹽和羥基基團等，而ROS則是促進NF-кB激活的最重要因素[14]。Huang等[15]將過度表達人銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)的轉基因小鼠MACO 1 h后進行再灌注，免疫組化顯示SOD1的過度表達可使缺血誘導的p65免疫反應活性降低，SOD1過度表達降低缺血誘導的NF-кB的DNA結合活性。本研究結果顯示MgSO4可有效抑制腦組織內自由基的生成，表明MgSO4能有效清除組織內的自由基；同時亦發現，MgSO4能夠升高局灶性腦缺血大鼠腦組織SOD活性，下調NF-кB蛋白的表達，推斷MgSO4可能是通過上調缺血腦組織SOD的表達而抑制NF-кB蛋白的表達。

隨著對Mg2+作用機制的深入研究，鎂劑可能成為治療缺血性腦損傷具有潛力的藥物，有望為缺血性腦損傷的治療開辟新的途徑。

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The effects of magnesium sulfate on oxidative stress and expression of NF-кB after focal cerebral ischemia in rats

MINHeming，JIAYujie，JIANGXingqian，etal.

(DepartmentofCellBiology，CollegeofBasicMedicineofJinzhouMedicalUniversity，Jinzhou121001，China)

ObjectiveTo investigate the effects of different doses of magnesium sulfate(MgSO4) on oxidative stress and expression of NF-kappa after focal cerebral ischemia in rats. MethodsSixty SD rats were randomly divided into sham operation group，model group and Magnesium sulfatein group 30，60 and 120 mg/kg treatment groups. Using thread embolism method prepared rat permanent middle cerebral artery ischemia model(MCAO). the sham operation group and model group were given intraperitoneal injection of 1 ml normal saline postoperative immediately. By intraperitoneal injection of MgSO4each dose group according to the dose of 250 g/L MgSO4injection(were diluted with saline to 1ml). After 24 hours，the activity of superoxide dismutase(SOD) and the content of malondialdehyde(MDA) were measured in brain homogenate，meanwhile the histopathological changes of cerebral tissues were observed and at the same time the expression NF-kappa B protein positive cells were evaluated in each group by immunohistochemistry. ResultsCompared with the model group，the activity of SOD in magnesium sulfate 60 and 120 mg/kg groups were significantly higher than those in the model group (P=0.000)，while magnesium sulfate 30 mg/kg had not statistical significance；the MDA content of magnesium sulfate in each dose group were significantly lower than those of the model group (P=0.000)；Magnesium sulfate in magnesium sulfate 60 and 120 mg/kg groups of NF-kappa B protein positive cells decreased significantly (P=0.000)，while magnesium sulfate 30 mg/kg had not statistical significance. Compared with magnesium sulfate 30 mg/kg，the activity of SOD in magnesium sulfate 120 mg/kg increased significantly (P=0.015)，while magnesium sulfate 60 mg/kg had not statistical significance；the MDA content in magnesium sulfate 60 and 120 mg/kg groups were significantly lower than those in the model group (P=0.001andP=0.000)，the expression of NF-kappa B protein positive cells in magnesium sulfate 60 and 120 mg/kg groups decreased significantly，the differences had statistical significance(P=0.000). ConclusionMagnesium sulfate has protective effect on oxidative damage in rats after focal cerebral ischemia，and its mechanism may be related to free radical scavenging，reducing the expression of oxidative damage and inhibition of NF-kappa B protein.

Magnesium sulfate；Cerebral ischemia；Superoxide dismutase；Malondialdehyde；Nuclearfactor kappa B

1003-2754(2016)07-0588-04

2016-01-20；

2016-05-02

國家自然科學基金資助(No. 81202783)

(1.錦州醫科大學基礎醫學院細胞生物學教研室，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫科大學附屬第一醫院神經內科，遼寧 錦州 121001)

包翠芬，E-mail：mianyizuhua@aliyun.com

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