促紅細胞生成素預處理在腦缺血性損傷中神經保護作用的體外研究

王曉芳，王　妮，呂曉紅

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促紅細胞生成素預處理在腦缺血性損傷中神經保護作用的體外研究

王曉芳，王妮，呂曉紅

目的在體外研究重組人促紅細胞生成素(rhEPO)預處理在腦缺血性損傷中的神經保護作用及其合適的劑量范圍、時間窗。方法取處于生長穩定期的高純度原代皮質神經元，分為正常對照組、糖氧奪獲(OGD)損傷組、rhEPO預處理組。rhEPO預處理組是在不同時間(OGD損傷前24 h、48 h、72 h)給予不同濃度(0.01 U/ml、0.1 U/ml、1 U/ml、10 U/ml、100 U/ml)的rhEPO，最后以MTT比色法檢測存活率，光鏡下觀察細胞形態變化。結果rhEPO(0.01 U/ml、0.1 U/ml、1 U/ml、10 U/ml)預處理可明顯增加OGD損傷的原代皮質神經元的存活率(P<0.05)，其中當濃度為1 U/ml時保護作用最強(P<0.05)；rhEPO(1 U/ml)預處理24 h、48 h可明顯增加OGD損傷的原代皮質神經元的存活率(P<0.05)，其中rhEPO預處理48 h的保護作用強于24 h。在光學顯微鏡下，觀察到的細胞形態和數量的變化與以上結果相符。結論rhEPO預處理對OGD損傷的皮質神經元具有神經保護作用，其有效濃度為0.01～10 U/ml，其中最佳劑量為1 U/ml，其有效時間窗為OGD前48 h或24 h，最佳干預時間窗為OGD前48 h。

促紅細胞生成素預處理；體外培養神經元；糖氧奪獲；神經保護

近年來，促紅細胞生成素對缺血性腦血管病的神經保護作用逐漸受到重視，目前利用重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)防治缺血性腦血管病的研究以動物模型為主，但rhEPO難以通過血腦屏障，且容易受到其他因素干預，本研究于體外建立原代神經元糖氧奪獲(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，以研究rhEPO預處理的神經保護作用。

1　材料和方法

1.1動物健康新生24 h內清潔級Wistar大乳鼠，雌雄不限，由吉林大學動物中心提供[實驗動物質量合格證號為SCXK(吉)2013-0001]，做原代皮質神經元的培養。

1.2主要試劑rhEPO(沈陽三生制藥股份有限公司，10000 kU/L，生產批號：201506114V)；無糖DMEM培養基(Gibco公司，美國)；Neurobasal-A培養基(Gibco公司，美國)；B27(Gibco公司，美國)；L-谷氨酰胺(Gibco公司，美國)；青霉素/鏈霉素(160 萬u/100ml)(Sigma公司，美國)；兔抗鼠神經元特異烯醇化酶(武漢博士德公司)；山羊抗兔免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)；DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)；噻唑藍(Sigma公司，美國)；DMSO(Sigma公司，美國)。

1.3實驗方法

1.3.1新生大鼠皮質神經元的原代培養取出生24 h內的Wistar大乳鼠2只，浸入70%乙醇消毒后，無菌下解剖分離雙側大腦皮質；將其剪為1 mm×1 mm×1 mm小塊，加入0.25%的胰酶8 ml，于37 ℃培養箱中消化20 min后，加入等體積終止液(含20%胎牛血清的DMEM/F12)終止消化，并用吸量管吹打30次；過濾，離心(1200 r/min×6 min)，倒去上清液；加入種植液(含10%胎牛血清的DMEM/F12)重懸，混合搖勻后計數，以1×106/L、5×105/L的密度接種于經多聚賴氨酸處理的96孔板和放有細胞爬片的24孔板中，然后置于含5%CO2、37 ℃的培養箱內培養；種板4 h后全量更換神經元專用培養液(48.5ml Neurobasal-A培養基+1 ml B27+0.5 ml L-谷氨酰胺+313 μl青鏈霉素)繼續培養；種板48 h后加入終濃度為5 μmol/L的5-溴-2’-脫氧尿苷(5-Fu)；種板72 h后全量換神經元培養液，之后每3 d半量換液，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態學特征(見圖1)。

1.3.2NSE鑒定將培養至7 d的細胞爬片取出，按鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(streptavidin-perosidase，SP)法進行免疫組織化學染色。同時用PBS替代第一抗體作為陰性對照。對于NSE免疫細胞爬片，每張隨機選取5個視野，高倍顯微鏡下計數細胞數即總細胞數，同一視野中胞質及其突起內含棕色顆粒者即神經元，神經元數目/總細胞數即為所得陽性率。

1.3.3原代皮質神經元生長曲線測定種板后3 d～12 d每天取一塊96孔板通過噻唑藍[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]比色法測量其光密度值(optical delnsity，OD)，每塊板種10孔，將所測得的OD平均值連成曲線。

1.3.4原代皮質神經元OGD模型建立結合1.3.2和1.3.3結果，可得種板后7 d～11 d為生長穩定期，并且神經元具有高純度，種板后7 d取4塊96孔板，每塊板種10孔，其中1塊為正常對照組，其余3塊全量換無糖DMEM，同時置于<1%O25%CO295%N2的培養箱中分別培養12 h、15 h、18 h，最后在光學顯微鏡下觀察細胞形態變化，并通過MTT比色法測量OD值，計算存活率。

1.3.5原代皮質神經元不同劑量rhEPO預處理與OGD損傷的關系種板后7 d取2塊96孔板，編號為1、2，分為3組：(1)正常對照組 取1號板，共種10孔，正常條件下培養；(2)OGD損傷組 取2號板 B2-B11孔，不加藥物處理，培養24 h后給予OGD處理15 h；(3)rhEPO預處理組 取2號板，于C2-C11、D2-D11、E2-E11、F2-F11、G2-G11分別給予10 μl/孔終濃度為100 U/ml、10 U/ml、1 U/ml、100 U/L、10 U/L的rhEPO，培養24 h后給予OGD處理15 h。最后于光鏡下觀察各組神經元形態變化，并采用MTT比色法測量其OD值，計算存活率。

1.3.6原代皮質神經元不同時間rhEPO預處理與OGD損傷的關系結合1.3.5，得最佳劑量為1 U/ml，于種板后第7d取2塊96孔板，同樣編號為1、2，分為3組：(1)正常對照組 取1號板，共種10孔，正常條件下培養；(2)OGD損傷組 取2號板 B2-B11孔，不加藥物處理，與rhEPO預處理組同時行OGD處理15h；(3)rhEPO預處理組 取2號板，在OGD15 h處理前24 h、48 h、72 h分別給予終濃度為1 U/ml的rhEPO預處理，各10孔。最后于光鏡下觀察各組神經元形態變化，并采用MTT比色法測量其OD值，計算存活率。

2　結　果

2.1NSE鑒定取7 d原代神經元行NSE免疫細胞化學染色鑒定，可得NSE陽性率在92.33%±2.88%。NSE陽性細胞表現為胞體及突觸均顯示棕黃色，細胞核被染為藍紫色，NSE陰性染色表現為胞體及突出無著色，僅細胞核被染為藍紫色(見圖2)。

2.2神經元生長曲線將10次OD值平均值連成曲線，可得3 d～7 d OD值為上升趨勢，7 d～11 d OD值趨向穩定，之后OD值下降(見圖3)。

2.3建立原代神經元體外OGD模型如圖4。隨OGD損傷時間的延長，原代神經元的生存率下降，其中OGD15h損傷對神經元生存率的影響適中，與OGD12h、OGD18h組相比，差異具有統計學意義(P<0.01)，可作為建模條件(見表1)。

2.4不同劑量rhEPO預處理對OGD損傷的原代皮質神經元存活率的影響如圖5。與OGD損傷組比較，rhEPO預處理濃度為0.01 U/ml～10 U/ml時，可提高原代神經元存活率，差異具有統計學意義(P<0.05)；其中當濃度為1 U/ml時，其神經保護作用最強，與其他劑量組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

2.5不同時間rhEPO預處理對OGD損傷的原代皮質神經元存活率的影響如圖6。與OGD損傷組相比，在OGD損傷之前24 h、48 h行終濃度為1 U/ml的rhEPO預處理，可提高原代皮質神經元的存活率，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與OGD損傷組相比，在OGD損傷之前72 h行同樣濃度的rhEPO預處理，則無神經保護作用，其差異無統計學意義(P>0.05)；rhEPO預處理48 h與rhEPO預處理24 h相比，神經保護作用更強，差異有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

表1　不同時間OGD對原代皮質神經元存活率的影響

模型組1、2、3分別與正常對照組相比*P<0.01；模型組2分別與模型組1、3相比ΔP<0.01

表2　不同劑量rhEPO預處理對原代皮質神經元存活率的影響

rhEPO預處理組2、3、4、5與OGD損傷組相比*P<0.05； rhEPO預處理組3與其余各組相比ΔP<0.05

表3　不同時間rhEPO預處理對原代皮質神經元存活率的影響

rhEPO預處理組①、②分別與OGD損傷組相比*P<0.05 ；rhEPO預處理組①與rhEPO預處理組②相比ΔP<0.05

3　討　論

近年來，已有動物研究和體外研究表明內源性或外源性EPO預處理對腦缺血性損傷具有神經保護作用，其機制與其參與抗細胞凋亡的信號轉導通路[1～4]、抗炎性作用[5]、抗氧化應激[6]、保護血腦屏障[7]、增加血管生成反應[8]等其他保護機制有關。該體外研究通過比較缺糖缺氧原代皮質神經元經rhEPO預處理干預后存活率的變化及光學顯微鏡下形態學的變化，發現EPO預處理在腦缺血性損傷中的神經保護作用存在有效劑量范圍和有效時間窗。

對純度達90%以上的原代皮質神經元于其生長平臺期給予OGD損傷 15 h，損傷率可達40%左右，若預先給予rhEPO處理24 h，可見當rhEPO濃度達1 U/ml時其神經保護作用最大，當濃度達100 U/ml時，其神經保護作用消失，該結果提示rhEPO對神經細胞的活性可能呈雙向調節作用，高濃度EPO可能是抑制神經細胞活性的因素之一。Ruscher等曾在腦缺血性損傷的體外研究中發現100 U/L rhEPO預處理相對于10 U/L、1 U/L的濃度神經保護作用更強[1]，該研究劑量范圍較窄，無更高濃度rhEPO預處理研究。楊慧等對原代皮質神經元進行類似體外實驗，進行了更高濃度rhEPO預處理研究，表明1 U/ml rhEPO組的細胞活性分別高于0.1 U/ml、10 U/ml組[9]。本研究結果與楊慧等的研究結果大致是一致的，揭示了rhEPO預處理在腦缺血性損傷中神經保護作用的劑量依賴性曲線為鐘型，其最適濃度在1 U/ml左右。其可能的機制為：神經元表面分布有兩種類型的促紅細胞生成素受體(Erythropoietin receptor，EPOR)，即高親和力的同源二聚體EPOR/EPOR和低親和力的異源二聚體EPOR/CD131，其中的CD131是粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)、白細胞介素-3(interleukin-3，IL-3)與IL-5的三種受體中的β共同亞基(hβc)，EPOR/CD131發揮神經保護作用；高濃度的EPO會促使EPOR的表達量顯著增加，而CD131卻未隨之增加，這使得原來相對豐富的EPOR/CD131的比例明顯降低，再者它的親和力較低，從而高濃度的EPO治療反而產生不利作用[10]。

另外，該體外研究表明EPO預處理在腦缺血性損傷中的神經保護作用也是需要滿足一定時間窗的。同樣對高純度原代皮質神經元給予濃度為1 U/ml不同時間的rhEPO預處理，發現48 h時神經保護作用最強，24 h次之，72 h時則未發現神經保護作用。Ruscher等曾在體外研究中也發現rhEPO治療后提供的對神經元的保護作用并非是持續不斷的，即5 min時保護作用較強，之后保護作用減弱，24 h后保護作用再次加強，并于48 h達到高峰，早期的保護作用可能是在翻譯后水平進行調節，而24 h之后的保護作用則可能是在轉錄水平進行調節[1]。但在另一項活體研究中，分別在沙土鼠行腦缺血再灌注損傷前12 h、24 h、48 h給予腹腔注射1000 U/Kg rhEPO，EPO預處理24 h時其細胞凋亡數、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(InferleuKi-1β，IL-1β)含量最低，說明腦缺血前24 h為干預的最佳時間窗，推測與其清除自由基、抗炎性免疫反應及神經營養作用有關[11]。以上活體研究與體外研究結果不同可能與病理機制、EPO預處理參與的神經保護作用機制不完全相同有關，但都說明了rhEPO干預時間過短或是過長均不能達到最佳的神經保護作用。

目前已有rhEPO用于治療缺血性腦卒中的臨床研究，尚無rhEPO用于預防缺血性腦卒中的臨床研究，如何以最佳劑量、最佳時間窗未來應用于臨床尚需體外研究和活體研究的進一步摸索。

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Study on Neuroprotective Effect of Erythropoietin Pretreatment on Cerebral Ischemia Injury in Vitro

WANGXiaofang，WANGNi，LVXiaohong

(DepartmentofNeurologyandNeuroscienceCenter，FirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China)

ObjectiveTo study the protective effect of rhEPO pretreatment on cerebral ischemia injury and to explore the suitable dosage range and time window in vitro. MethodsThe primary cultured cerebral cortex neurons of high purity at stable growth phase were divided into three groups，namely the normal control group，oxygen-glucose deprivation group and rhEPO pretreation group. RhEPO in different concentration(0.01 U/ml、0.1 U/ml、1 U/ml、10 U/ml、100 U/ml) were given at different time points(24 h，48 h，72 h before OGD) in rhEPO pretreation group. The viability of cells was determined by MTT assay and cell morphology was observed under light microscopy. ResultsRhEPO pretreation at the concentration of 0.01、0.1、1、10 U/ml could significantly increase the viability of neurons damaged by OGD(P<0.05)respectively and when the concentration of rhEPO was 1U·mL-1，the protective effect was the strongest(P<0.05). Before OGD，preincubation of neurons with 1U/ml rhEPO for 24h or 48h induced a prolonged neuroprotection(P<0.05). The maximum of protection was observed after a pretreatment period of 48h(P<0.05). These findings could also be proven by the improved morphology of neurons. ConclusionOur studies had revealed the markedly neuroprotective effect of rhEPO pretreatment on the cerebral cortical neurons in OGD. It’s effective concentration was 0.01～10 U/ml and the most effective concentration was 1 U/ml. Further more，the effective time window was 48 h or 24 h before OGD，of which 48 h before OGD was better.

Erythropoietin Pretreatment；Neurons Cultured in Vitro；OGD；Neuroprotection

1003-2754(2016)07-0584-04

2016-05-19；

2016-06-20

(吉林大學白求恩第一醫院神經內科，吉林 長春 130021)

呂曉紅，E-mail：lvxiaohong. student@ sina.com

R743

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