直接免疫熒光法檢測(cè)兒童呼吸道病毒抗原的結(jié)果分析

楊　泉，席金甌

(湖北省婦幼保健院檢驗(yàn)科，武漢 430000)

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直接免疫熒光法檢測(cè)兒童呼吸道病毒抗原的結(jié)果分析

楊泉，席金甌△

(湖北省婦幼保健院檢驗(yàn)科，武漢 430000)

目的評(píng)價(jià)直接免疫熒光法對(duì)兒童呼吸道病毒抗原的診斷價(jià)值，并探討兒童呼吸道病毒的流行特征。方法用直接免疫熒光法檢測(cè)6 282例住院兒童呼吸道分泌物中呼吸道合胞病毒(RSV)，流感病毒A型(FLUA)，流感病毒B(FLUB)，副流感病毒1型(PIV1)，副流感病毒2型(PIV2),副流感病毒3型(PIV3)和腺病毒(ADV)7種呼吸道病毒。結(jié)果6 282例標(biāo)本中病毒陽(yáng)性檢出835例，總陽(yáng)性率13.29%；其中RSV最高，陽(yáng)性率8.83%；其次是PIV3，陽(yáng)性率2.80%；冬季發(fā)病較高，夏季最少。0～6個(gè)月的幼兒發(fā)病率較高。結(jié)論直接免疫熒光法簡(jiǎn)單、快速，可用于兒童呼吸道病毒感染的早期診斷。

呼吸道感染；兒童；呼吸道病毒；直接免疫熒光

呼吸道病毒感染是常見(jiàn)感染性疾病，目前證明大部分是由病毒感染引起，呼吸道病毒感染以空氣或飛沫形式傳播。病毒種類繁多，癥狀相似，臨床上很難鑒別[1]，因此快速鑒別呼吸道病毒抗原對(duì)兒童呼吸道感染的早期診斷、治療和預(yù)后有十分重要的意義。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2014年1～12月在湖北省婦幼保健院兒科住院的呼吸道感染患兒共6 282例，其中男3 451例、女2 831例，年齡0～12歲。春季1 651例，夏季1 289例，秋季1 544例，冬季1 798例。0～6個(gè)月1 342例，>6個(gè)月至1歲1 621例，>1～3歲1 852例，>3歲1 467例。

1.2儀器與試劑熒光顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)，檢測(cè)試劑盒由美國(guó)的Diagnostic Huybrids.INC公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集使用無(wú)菌的8#嬰兒輸液軟管收集鼻咽抽吸液，該軟管與一次性的抽吸液采集管和抽液裝置相連接，在患者處于仰臥體位時(shí)，將1～2 mL生理鹽水注入患者鼻腔然后吸出。抽吸液和灌洗液應(yīng)用等體積的運(yùn)輸培養(yǎng)基在裝有無(wú)菌玻璃珠的離心管中稀釋。

1.3.2細(xì)胞涂片制備劇烈漩渦標(biāo)本10～15 s，(400～600)×g離心5～10 min，收集上清液并將其另置，用于病毒分離，加入5 mL的1×PBS，劇烈渦旋10～15 s，(400～600)×g離心5～10 min，并棄去上清液，重復(fù)數(shù)次，將沉淀加入0.5～1 mL的1×PBS液，劇烈渦旋15 s后在8孔的玻片上每孔分別加入25 μL標(biāo)本懸浮液，將這些孔完全風(fēng)干，冷丙酮固定。

1.3.3直接標(biāo)本檢測(cè)分別加一滴各種呼吸道病毒的熒光試劑于8孔對(duì)應(yīng)的孔中，留一孔作為陰性，對(duì)于呼吸道抗原對(duì)照玻片分別加入一滴各種呼吸道病毒的熒光試劑于已標(biāo)示的對(duì)應(yīng)孔中，一起進(jìn)行直接免疫熒光檢測(cè)。

1.4原理采用熒光素直接標(biāo)記的針對(duì)呼吸道病毒的特異性單克隆抗體，對(duì)呼吸道病毒進(jìn)行快速檢測(cè)和鑒定。該試劑盒包括1瓶呼吸道病毒熒光試劑，含有FITC標(biāo)記的分別針對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、副流感病毒1～3型(PIV 1、2、3)、流感病毒A型(FLUA)、流感病毒B型(FLUB)的單克隆抗體混合物。另有分別含有針對(duì)相應(yīng)病毒的單克隆抗體，該試劑盒可直接對(duì)標(biāo)本或細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。用于檢測(cè)的細(xì)胞來(lái)自于臨床標(biāo)本，用丙酮固定載體上，呼吸道病毒熒光試劑被加于其上以檢測(cè)是否有呼吸道病毒抗原存在。在35～37 ℃孵育后，用洗滌液進(jìn)行洗滌，然后加上封固液，用蓋玻片覆于其上。最后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。病毒感染的細(xì)胞被染上綠色熒光，未感染上的細(xì)胞無(wú)熒光但會(huì)染上紅色。如標(biāo)本中有感染的細(xì)胞，則進(jìn)一步用各種針對(duì)不同病毒的熒光試劑進(jìn)行檢測(cè)，以鑒定其感染的病毒種類。如果直接對(duì)標(biāo)本檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記的細(xì)胞并且所有細(xì)胞都被染成紅色，將標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并用呼吸道病毒熒光試劑復(fù)檢。如果觀察到陽(yáng)性結(jié)果，再按照上述步驟進(jìn)行鑒定檢測(cè)，將細(xì)胞用丙酮固定于載體上，分別將各種針對(duì)不同病毒的熒光試劑加于其上，在35～37 ℃孵育后，用洗滌液進(jìn)行洗滌。然后加一滴封固液，用蓋玻片覆于其上，最后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。病毒感染的細(xì)胞被染上綠色熒光，這樣可以確定待檢的呼吸道病毒的種類。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1病毒檢出率6 282例患兒中檢出呼吸道病毒感染835例，總陽(yáng)性率為13.29%，其中RSV最高(8.83%，555/6 282)，其次PIV3(2.8%，176/6 282)、FLUA(0.7%，44/6 282)、ADV(0.35%，22/6 282)、FLUB(0.25%，16/6 282)、PIV1(0.24%，15/6 282)、PIV2(0.11%，7/6 282)。不同季節(jié)各類病原體檢出率比較見(jiàn)表1。冬季發(fā)病最高(19.9%)，其次是春季發(fā)病(13.45%)、秋季發(fā)病(9.84%)，夏季發(fā)病最少(7.91%)。冬、春季增高，夏、秋季降低。

2.2不同年齡各類病原體檢出率比較0～6個(gè)月發(fā)病率最高(20.86%)，其次>1～3歲(14.63%)和>6個(gè)月至1歲(13.51%)，>3歲的最低(4.43%)。見(jiàn)表2。

表1　　不同季節(jié)各類兒童呼吸道病毒檢測(cè)率[n(%)]

表2　　不同年齡各類兒童呼吸道病毒檢測(cè)率[n(%)]

3　討　　論

急性呼吸道病毒感染是導(dǎo)致發(fā)展中國(guó)家兒童住院及死亡的常見(jiàn)疾病，RSV、FLUA、FLUB、PIV1、PIV2、PIV3、ADV感染是多發(fā)急性呼吸道感染的常見(jiàn)原因[2]。在診斷是否有細(xì)菌引起的呼吸道感染中，病毒檢測(cè)變得越來(lái)越重要，采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)直接抗原標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)是病毒實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。呼吸道感染常為季節(jié)性的，流感病毒典型的流行期為冬季和春季，ADV常發(fā)于晚冬至早夏，RSV好發(fā)于早春和冬季，PIV則在全年都有可能發(fā)生。因此進(jìn)行早期快速的呼吸道病毒檢測(cè)十分重要。有研究證明呼吸道病毒抗原檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果的患者接受抗菌藥物治療的時(shí)間明顯縮短，這樣既可以減少抗菌藥物的使用，又使住院時(shí)間縮短[3-4]。

目前診斷呼吸道病毒感染的方法較多。傳統(tǒng)方法為電鏡檢測(cè)病毒顆粒，但陽(yáng)性率低，診斷時(shí)間較長(zhǎng)，且電鏡難以在臨床實(shí)驗(yàn)室普及；病毒分離培養(yǎng)過(guò)去常作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、要求高，很難常規(guī)普及；堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(APPAAP)僑聯(lián)酶標(biāo)法，操作步驟繁雜易出現(xiàn)非特異性著色，陽(yáng)性結(jié)果難以判斷；血清學(xué)方法由于特異性抗體產(chǎn)生慢、滴度低。分子檢測(cè)是呼吸道病毒檢測(cè)的新標(biāo)準(zhǔn)，分子方法(如PCR技術(shù))的靈敏度比組織培養(yǎng)方法高12%～30%，但PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)要求高，易污染[5]。尋求一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)兒童呼吸道感染的早期診斷有重要的意義。因此本研究用直接免疫熒光法檢測(cè)兒童呼吸道病毒抗原，結(jié)果顯示，病毒檢出835例，總陽(yáng)性率13.29%，檢出率低于國(guó)內(nèi)外大多數(shù)地區(qū)，如廣州69.7%[6]，常州25.93%[7]，廈門42.5%[8]，可能本院是婦幼保健院病例較多的原因。其中RSV最高占總陽(yáng)性8.8%，RSV是武漢地區(qū)的重要病原體，與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道一致。RSV是兒童下呼吸道感染最常見(jiàn)的病毒體,嬰幼兒最高,通常在冬春季節(jié)流行[9]。其次是PIV3占總陽(yáng)性數(shù)的2.8%，ADV卻不是武漢地區(qū)的主要感染原因。冬季發(fā)病較高，RSV檢出284例(15.79%)最高，其次為FLUA檢出40例(2.24%)；夏季RSV檢出11例(0.85%)最少，PIV3檢出74例(5.74%)最高。武漢地區(qū)冬季陰冷，早晚溫差大，是兒童呼吸道病毒感染的高發(fā)季節(jié)，0～6個(gè)月的幼兒發(fā)病率較高，嬰幼兒檢測(cè)率高可能與嬰幼兒期細(xì)胞免疫功能尚未完成，氣道分泌物中缺少分泌型免疫球蛋白A(SIgA)有關(guān)，且血清中母體抗體降低，而自身產(chǎn)生的IgG水平不高有關(guān)[10]。這個(gè)階段的幼兒免疫系統(tǒng)較弱，呼吸道黏膜還沒(méi)有發(fā)育健全，較易發(fā)生感染。因此本研究用直接免疫熒光檢測(cè)兒童呼吸道病毒抗原，方法簡(jiǎn)便、快速，為保證質(zhì)量，在每次染色時(shí)，都同時(shí)需對(duì)一片未使用過(guò)的呼吸道病毒抗原對(duì)照玻璃片進(jìn)行染色，以保證結(jié)果的可靠性。該方法準(zhǔn)確可靠，值得推廣，對(duì)兒童呼吸道感染用藥具有指導(dǎo)作用，同時(shí)能監(jiān)督并預(yù)測(cè)可能傳播的病毒亞型，以指導(dǎo)疫苗的生產(chǎn)。

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