黃酮對刺葡萄花色苷輔色穩定化效果的研究

王維茜，鄧潔紅，2，*，田小燕，劉永紅（.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙4028；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙4028；.湖南生物機電職業技術學院，湖南長沙4027）

黃酮對刺葡萄花色苷輔色穩定化效果的研究

王維茜1，鄧潔紅1，2，*，田小燕1，劉永紅3
（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；
2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；3.湖南生物機電職業技術學院，湖南長沙410127）

研究了幾種黃酮類物質對刺葡萄花色苷的輔色作用，并研究了槲皮素、黃芩素和蘆丁對刺葡萄花色苷熱穩定性的影響。結果表明：槲皮素對刺葡萄花色苷的輔色效果最為顯著（p＜0.05），其次是黃芩素和蘆丁，濃度為0.1 mmol·L-1時單位濃度輔色效果最佳；槲皮素和黃芩素輔色時，在pH2.0處，輔色效果最好，而蘆丁輔色時，最佳pH為3.0。加入槲皮素、黃芩素、蘆丁后，刺葡萄花色苷的降解速率常數（k）皆顯著小于對照組，半衰期（t1/2）均顯著高于對照組（p＜0.05）。經槲皮素、黃芩素、蘆丁輔色后刺葡萄花色苷的活化能（Ea）分別為88.48、91.67、83.62 kJ/mol，顯著（p＜0.05）高于對照組的74.51 kJ/mol，說明加入槲皮素、黃芩素、蘆丁能提高刺葡萄花色苷的熱穩定性。

刺葡萄花色苷，黃酮，輔色，熱穩定性

花色苷作為一種天然色素安全性較高，具有特殊的芳香氣味和一定的營養和藥理功效，且資源豐富，是各國公認的替代合成食用色素的最理想的天然食用色素［1］。但花色苷穩定性較差，易受到親核試劑的進攻而水解，影響花色苷穩定性的主要因素有pH、溫度、濃度、結構、光、氧氣、抗壞血酸、二氧化硫和輔色劑等［2-4］，使其在實際生產應用中受到限制。輔色作用包括通過共價鍵方式連接形成的分子內輔色和以范德華力、疏水及離子相互作用為主要驅動力的分子間輔色［5-6］。輔色法是提高花色苷穩定性的一種經濟、有效的方法，通過在花色苷溶液中添加氨基酸、生物堿、類黃酮、有機酸等輔色劑來提高其穩定性［7］。與未添加輔色劑的花色苷溶液相比，輔色作用后的花色苷溶液會出現最大吸收波長向長波方向移動和吸光度值增加的現象，即紅移現象和增色效應［8］。王萌等［9］研究發現DL-蘋果酸、檸檬酸和酒石酸都不同程度提高了紫甘薯花色苷的熱穩定性，而能與大多數色素有效輔色的阿魏酸和咖啡酸卻對紫甘薯花色苷熱穩定性不利，可能與紫甘薯花色苷的結構有關。李永強等［10］以浸泡型楊梅酒為模型，證明了在不同貯藏時期，黃酮含量與色調、最大吸收波長和花色苷含量呈極顯著正相關。

本研究以純化的刺葡萄花色苷（SGA）為試材，研究黃酮類物質與刺葡萄花色苷分子之間發生輔色作用的條件，比較不同黃酮類物質對刺葡萄花色苷的輔色效果，探究黃酮對刺葡萄花色苷熱降解規律，為實現葡萄酒生產過程中花色苷的穩定化提供理論和應用借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺葡萄果皮 購于湖南省芷江縣，洗凈，晾干，手工剝皮，-40℃條件下凍藏備用；陳皮素、苦丁、槲皮素、黃芩素、葛根素、大豆素 西安旭煌生物技術有限公司；兒茶素、異甘草素 澤朗植提CPE?；檸檬酸、檸檬酸鈉、無水乙醇、鹽酸、冰醋酸、氯化鉀 均為國藥集團，分析純。

UV-2450紫外可見分光光度計 SHIMADZU；AEY-220型電子天平 湘儀天平儀器設備有限公司；HH-8型數顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學儀器；PHS-3C型pH計 上海精科；101-2AB型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；SHB-ⅢT循環水式多用真空泵 鄭州長城科工有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺葡萄花色苷的制備［11］稱取100 g刺葡萄皮于燒杯中，以1∶6的料液比加入70%酸化乙醇（含0.03%鹽酸），30℃條件下避光浸提24 h，抽濾，旋轉蒸發（溫度≤40℃）回收乙醇，3000 r/min離心20 min，加水稀釋10倍后為后續實驗用色素液，避光備用。

1.2.2 黃酮種類對刺葡萄花色苷輔色效果的影響 取5 mL色素液于具塞比色管中，分別用濃度為1.0 mmol·L-1的黃酮乙醇溶液（陳皮素、蘆丁、槲皮素、黃芩素、葛根素、大豆素、兒茶素和異甘草素）定容至20 mL，混勻，避光靜置24 h后，以5 mL色素液用乙醇定容至20 mL為對照，掃描450～600 nm范圍內可見吸收光譜，記錄最大吸收波長（λmax）和最大吸光度值（Amax），以每毫摩爾黃酮引起的刺葡萄色素溶液吸光度值的增加量（I）來考察黃酮輔色效果［12］。

式中：Amax為加入黃酮后色素溶液的最大吸光度值；A0為對照組色素溶液的最大吸光值；C為黃酮類物質的終濃度（mmol·L-1）。

1.2.3 黃酮濃度對刺葡萄花色苷輔色效果的影響 取5 mL色素液于具塞比色管中，分別加入一定量槲皮素、黃芩素、蘆丁，用pH 3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液定容至20 mL，使溶液體系中槲皮素、黃芩素、蘆丁的濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1。避光靜置24 h后，以5 mL色素液用pH3.0的緩沖液定容至20 mL為對照，測定450～600 nm范圍內最大吸收波長λmax和最大吸光值Amax，計算輔色效果（I值）。

1.2.4 pH對黃酮輔色刺葡萄花色苷效果的影響 取10 mL色素液于具塞比色管中，分別加入一定量槲皮素、黃芩素、蘆丁，用pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的緩沖溶液（pH1.0為KCl-HCl緩沖液，pH2.0為磷酸鹽緩沖液，pH3.0～6.0為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液）分別定容至50 mL，使黃酮的終濃度為0.1 mmol·L-1。避光靜置24 h后，以色素液中加入等量緩沖液為對照，測定λmax和Amax，計算其與對照的差值Δλmax和ΔAmax，并計算輔色效果（I值）。

1.2.5 黃酮輔色對刺葡萄花色苷熱穩定性的影響 取10 mL色素液于具塞比色管中，分別加入一定量槲皮素、黃芩素、蘆丁，用pH3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液定容至100 mL，使色素液中各黃酮類物質的濃度均為0.1 mmol·L-1。取加入槲皮素、黃芩素、蘆丁的色素液10 mL各四份，分別置于20、40、60、80℃的水浴中避光加熱，每隔2 h取樣置于冰浴中迅速冷卻，測定吸光值，并計算花色苷保存率。

花色苷保存率（%）=（Ax/A0）×100

其中，A0、Ax分別為520 nm處對照組的吸光度值與黃酮輔色后的吸光度值。

對刺葡萄花色苷的熱處理進行熱降解動力學研究，計算相應的熱降解動力學參數（反應速率常數k、半衰期t1/2和活化能Ea），連續測12 h［13］。

1.3 數據處理

實驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示，數據采用SPSS軟件處理。

2 結果與分析

2.1 黃酮種類對刺葡萄花色苷輔色效果的影響

表1 黃酮對刺葡萄花色苷的輔色效果Table1 Copigmentation effect of flavonoids on SGA

由表1可見，黃酮類物質均能在一定程度上增加刺葡萄花色苷的最大吸光度值，最大吸收波長均發生了紅移（1.0～2.5 nm），但影響不大。黃酮類物質均能顯著增加刺葡萄花色苷的最大吸光度值，但添加槲皮素、黃芩素和蘆丁后的刺葡萄花色苷溶液的吸光度值與對照組相比，差異極顯著（p＜0.01），增色效果更好，其中槲皮素對刺葡萄花色苷的輔色效果最為顯著，其次是黃芩素和蘆?。╬＜0.05）。因此選擇槲皮素、黃芩素和蘆丁作為輔色劑進一步研究。

2.2 黃酮濃度對刺葡萄花色苷輔色效果的影響

實驗中發現，添加黃酮輔色后，刺葡萄花色苷溶液的最大吸收波長均發生了紅移（1.0～2.5 nm），但紅移程度并未與輔色劑濃度呈現明顯的線性關系。由圖1～圖3可知，隨槲皮素、黃芩素和蘆丁濃度的增大，刺葡萄花色苷溶液的最大吸光度值逐漸增大，具有增色效應，當黃酮濃度增加到0.1 mmol·L-1時I值達到最大，輔色效果最好，此時溶液吸光度值也接近最大值。黃酮濃度為0.2 mmol·L-1吸光度值達到最大值，但輔色效果急劇減弱，原因可能是黃酮與花色苷分子結合不緊密，部分輔色基團的脫落導致吸光度值未持續升高，增加黃酮濃度，輔色基團與花色苷分子繼續結合，但由于黃酮濃度為0.2 mmol·L-1時刺葡萄花色苷溶液已經完全輔色，故繼續增加黃酮濃度對增色無顯著作用。根據不同濃度黃酮對刺葡萄花色苷的增色效果和節約試劑成本考慮，槲皮素、黃芩素和蘆丁均選擇0.1 mmol·L-1濃度做后續實驗。

圖1 槲皮素對刺葡萄花色苷的輔色效果Fig.1 Copigmentation effect of quercetin on SGA

圖2 黃芩素對刺葡萄花色苷的輔色效果Fig.2 Copigmentation effect of baicalein on SGA

圖3 蘆丁對刺葡萄花色苷的輔色效果Fig.3 Copigmentation effect of rutin on SGA

2.3 pH對刺葡萄花色苷輔色效果的影響

表2 pH對槲皮素輔色效果的影響Table2 Effect of pH on the copigmentation effect of quercetin on anthocyanins

表3 pH對黃芩素輔色效果的影響Table3 Effect of pH on the copigmentation effect of baicalein on anthocyanins

表4 pH對蘆丁輔色效果的影響Table4 Effect of pH on the copigmentation effect of rutin on anthocyanins

pH是影響花色苷分子存在形式的主要因素，一般輔色劑在酸性條件下能與花色苷形成增色團而增強花色苷溶液的顏色及穩定性。由表2～表4可知，槲皮素、黃芩素和蘆丁對刺葡萄花色苷發生了輔色作用，△λmax和△Amax有不同程度的提高，輔色效果均隨pH的增加先增大后逐漸減小，pH的變化對黃酮類物質的輔色效果影響較大。槲皮素和黃芩素輔色時，在pH2.0處，I值達到最大，輔色效果最好；而蘆丁輔色時，則在pH3.0處，I值達到最大。原因可能是pH＜1.0時，花色苷以黃鹽陽離子的形式存在與輔色劑發生作用，而pH＞2.0時，輔色劑能同時與花色苷的黃鹽陽離子和醌基形式同時作用，且有研究表明［14］，花色苷以醌堿形式存在時與輔色劑相互作用，輔色效果更強。

2.4 黃酮對刺葡萄花色苷熱穩定性的影響

圖4 黃酮對刺葡萄花色苷熱穩定性的影響Fig.4 Effect of flavonoids on thermal stability of VSA

由圖4可知，20℃時，對照組刺葡萄花色苷的保存率隨時間的延長有小幅度下降，而輔色后花色苷溶液由于增色效應保存率在6 h內小幅上升，然后基本穩定，觀察期內（12 h）未發現花色苷降解現象，故未計算20℃時輔色條件下的熱降解參數。在40、60、80℃加熱過程中，黃酮輔色后的刺葡萄花色苷保存率顯著高于對照組（p＜0.05），這表明在加熱條件下，黃酮對花色苷的輔色效應仍然存在，輔色作用可以提高花色苷的熱穩定性。刺葡萄花色苷溶液本身及其輔色后的花色苷溶液保存率隨加熱溫度的升高和時間的延長呈下降趨勢。經槲皮素、黃芩素、蘆丁輔色后的刺葡萄花色苷溶液80℃加熱12 h，保存率與加熱前相比，分別降低了30.87%、29.00%和35.31%，而對照組刺葡萄花色苷保存率降低了49.64%，經3種黃酮輔色后刺葡萄花色苷的熱穩定性顯著提高（p＜0.05）。

研究表明，加入黃酮后，刺葡萄花色苷的熱降解符合一級熱降解動力學［15］。由表5可知，加入槲皮素、黃芩素、蘆丁后，刺葡萄花色苷的速率常數（k）皆顯著小于對照組，半衰期（t1/2）都顯著高于對照組（p＜0.05），如80℃條件下，對照組的半衰期為12.12 h，槲皮素、黃芩素、蘆丁輔色后刺葡萄花色苷的半衰期分別為22.53、24.29、19.10 h，說明加入槲皮素、黃芩素、蘆丁能提高刺葡萄花色苷的熱穩定性。對照組刺葡萄花色苷的活化能（Ea）為74.51 kJ/mol，槲皮素、黃芩素、蘆丁輔色后刺葡萄花色苷的活化能分別為88.48、91.67、83.62 kJ/mol，其中黃芩素活化能相比對照組提高23.03%，說明加入黃酮輔色后，刺葡萄花色苷對溫度的敏感度降低。槲皮素、黃芩素、蘆丁有可能作為輔色劑運用于刺葡萄花色苷溶液的熱處理護色過程中。

表5 黃酮對刺葡萄花色苷熱降解動力學參數的影響Table5 Kinetics parameters for the thermal degradation of SGA with flavonoids

3 討論與結論

8 種黃酮類物質均能顯著增加刺葡萄花色苷的最大吸光度值，但添加槲皮素、黃芩素和蘆丁后的刺葡萄花色苷溶液的最大吸光度值與對照組相比，差異極顯著，增色效果好，其中槲皮素對刺葡萄花色苷的輔色效果最為顯著，其次是黃芩素和蘆丁。

對于槲皮素、黃芩素和蘆丁3種輔色劑，當濃度為0.2 mmol·L-1時刺葡萄花色苷溶液已經完全輔色，繼續增加黃酮濃度對增色無顯著作用；槲皮素和黃芩素輔色時，在pH2.0處，輔色效果最好，而蘆丁輔色時，最佳pH為3.0；3種黃酮最大單位濃度輔色效果發生在0.1 mmol·L-1時。

添加槲皮素、黃芩素和蘆丁，可以提高刺葡萄花色苷的活化能，延長其半衰期，從而提高刺葡萄花色苷的熱穩定性。與未添加黃酮相比，0.1 mmol·L-1槲皮素、黃芩素和蘆丁分別使刺葡萄花色苷的活化能（74.51 kJ/mol）提高至88.48、91.67、83.62 kJ/mol，但其輔色作用的機制還需進一步深入研究。

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Study on copigmentation effect and stability of flavonoids on spine grape anthocyanins

WANG Wei-qian1，DENG Jie-hong1，2，*，TIAN Xiao-yan1，LIU Yong-hong3
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Key Laboratory of Food Science and Biological Technology of Hunan Province，Changsha 410128，China；3.Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic，Changsha 410127，China）

The copigmentation was studied on the spine grape anthocyanins by different flavonoids.The effects of quercetin，baicalein and rutin on the thermal stability of spine grape anthocyanins were also investigated.The results showed that the most significant copigment was quercetin（p＜0.05），followed by baicalein and rutin，and the best concentration of copigment was 0.1 mmol/L-1.Quercetin and baicalein had the best copigmentation effects at pH2.0，while rutin at pH3.0.The degradation rate（k）of spine grape anthocyanins decreased after adding quercetin，baicalein and rutin，and the half-life（t1/2）were improved（p＜0.05）.The activation energy（Ea）of quercetin，baicalein and rutin were 88.48，91.67 and 83.62 kJ/mol，respectively，all significantly（p＜0.05）higher than that of the control group which was 74.51 kJ/mol.The results indicated that quercetin，baicalein and rutin could improve the thermal stability of spine grape anthocyanins.

spine grape anthocyanins（SGA）；flavonoids；copigmentation；thermal stability

TS261.4

A

1002-0306（2016）02-0318-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.055

2015－07－07

王維茜（1990-），女，碩士研究生，研究方向：農產品加工及貯藏工程，E-mail：1731686696@qq.com。

*通訊作者：鄧潔紅（1967-），女，教授，研究方向：園藝產品深加工理論與技術，E-mail：hongjiedeng@163.com。

國家自然科學基金（31271836）；湖南省教育廳研究生科研創新課題（CX2015B264）。