蝦青素及維生素E聯用對急性酒精引起的氧化應激大鼠的影響

白云（呼倫貝爾職業技術學院，內蒙古呼倫貝爾021000）

蝦青素及維生素E聯用對急性酒精引起的氧化應激大鼠的影響

白云
（呼倫貝爾職業技術學院，內蒙古呼倫貝爾021000）

研究蝦青素與維生素E聯合作用對酒精誘導氧化應激大鼠血清及組織的影響。將50只雄性Wistar大鼠隨機分為5組：對照組（n=10）、模型組（n=10）、蝦青素組（n=10，0.6 g·kg-1·d-1）、維生素E組（n=10，0.2 g·kg-1·d-1）、蝦青素（0.3 g·kg-1·d-1）及維生素E（0.1 g·kg-1·d-1）聯用組（n=10）。連續30 d給予抗氧化劑，末次灌胃12 h后，除對照組外，其余各組灌胃12 mL/kg 50%酒精溶液誘導氧化應激。觀察各抗氧化劑組對大鼠的影響。研究表明單獨服用蝦青素（AX）及維生素E（VE）均可提高血清及心、肝、腎組織的總抗氧化能力（T-AOC）及谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，并且降低血清及心、肝、腎組織的丙二醛（MDA）含量。蝦青素組及維生素E組抗氧化效果均未有蝦青素及微生素E聯用組效果明顯。結果表明蝦青素與維生素E聯用可能具有協同作用，與單一抗氧化劑相比，蝦青素與維生素E聯用具有更強的抗氧化性，并對急性酒精引起的氧化應激具有明顯的保護效果。

蝦青素，維生素E，急性酒精，氧化應激，大鼠

蝦青素（Astaxanthin）呈紅色，是一種天然類胡蘿卜素，化學名稱為3，3′-二羥基-β，β-胡蘿卜素-4，4′-二酮?？蓮拇蠖鄶敌奉?、蝦類、魚類中分離得到［1］。近年來研究表明，蝦青素具有極強的抗氧化性，并被作為高級保健品進行開發。此外，很多研究者通過臨床實驗和動物實驗證明蝦青素可抑制腫瘤生長、增強免疫力、預防心血管疾病、抗氧化保肝等功能［2］。也有體外實驗證實它是單線態氧的淬滅劑，具有極強的清除自由基能力，是一種強抗氧化劑［3］。維生素E是一種脂溶性維生素，又稱為生育酚，它是生物體內的一種天然抗氧化劑。它對氧敏感，容易被氧化，故可以保護易被氧化的物質，降低氧化損傷。在生物系統中發揮著降低氧化應激、脂質過氧化的作用［4］。

有研究表明，蝦青素與維生素E的抗氧化性可降低磺粘菌素導致的腎氧化損傷［5］。氧化應激指生物系統遭受刺激時，體內活性氧自由基與活性氮自由基過度生成，氧化物的生成超過了氧化物的清除，氧化系統與非氧化系統失去平衡，導致組織損傷的過程。酒精提供了氧化應激產生的良好環境，酒精誘導的氧化應激直接參與生成活性氧（ROS），從而形成良好的氧化應激的環境，ROS參與各種生理及病理過程［6］。一定劑量的酒精破壞促氧化劑與抗氧化劑之間的平衡，導致生物分子的氧化損傷。維生素E、蝦青素這類抗氧化劑可以改善氧化損傷。體外研究已表明維生素E與蝦青素聯用可更有效抑制自由基產生，同時阻斷脂質過氧化物的合成［7］。目前，對蝦青素與維生素E單獨服用抑制氧化應激的研究很多，但是蝦青素及蝦青素維E聯用對酒精引起的氧化應激作用國內未見報道。

本實驗通過建立急性酒精氧化應激大鼠模型，并連續給予抗氧化藥劑，實驗結束后，測定各實驗組大鼠血清及各組織器官的組織勻漿中各抗氧化指標，對各抗氧化劑抗氧化能力進行評價，目的在于探討維生素E與蝦青素聯用對急性酒精引起的氧化應激的損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維生素E 購于西格瑪奧德里奇德國斯德海姆分公司；蝦青素（AstaREAL?） 購于富士化學產業株式會社美國分公司；無水酒精 為內蒙古赤峰瀚森化工有限公司產品，分析純試劑；總抗氧化力（TAOC）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒、谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒、蛋白質羰基（CP）檢測試劑盒 均購自南京建成生物工程研究所；Wistar大鼠 50只，雌性，體質量（180±20）g，由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2011-0004。

MK3型酶標儀 美國Thermo公司；IKA MS3型迷你振蕩器 廣東廣州儀科實驗室技術有限公司；ZY-1003S型數控超聲波清洗器 上海早贏精密清洗有限公司；HA-FJ200型高速分散均質機 北京潤恒奧儀器儀表設備有限公司；GTR16-2型高速冷凍離心機 北京時代北利離心機有限公司；艾本德移液槍 德國艾本德公司；96孔板 北京北方同正生物技術發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥方法 實驗動物在控制室［溫度：（24±2）℃，光照：12 h光照/黑暗循環，相對濕度50%±5%］中單籠飼養，大鼠自由進食、飲水［8］。7 d適應期結束后隨機分為5組：正常組、模型組、蝦青素組、維生素E組、蝦青素和維生素E聯用組。正常組（C）與模型組（M）每天灌胃1 mL生理鹽水，蝦青素組（AX）劑量0.6 g/（kg·d）灌胃（以植物油為溶媒，用高速分散均質機混勻），維生素E組（VE）劑量0.2 g/（kg·d）灌胃（以植物油為溶媒，用高速分散均質機混勻），蝦青素維生素E連用組（AXVE）灌胃劑量：0.3 g/（kg·d）蝦青素與0.1 g/（kg·d）的維生素E混合（以植物油為溶劑高速分散均質機混勻）［8］。

1.2.2 模型建立 實驗動物灌胃30 d，末次給藥12 h后，除正常組外，其余各組灌胃12 mL/kg 50%酒精溶液，6 h后，頸椎脫臼法處死動物，抽取血樣及分離組織。

1.2.3 指標測定 血液生化指標測定：實驗結束時大鼠股動脈取血，將分離出的血清（4℃，3000 r/min，10 min）保存于-80℃備用。按試劑盒說明書方法測定T-AOC、SOD、MDA、GSH-PX、GSH、CP。

組織生化指標測定：取肝、心、腎組織在冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，用滅菌生理鹽水做勻漿介質4℃下制得10%肝、心、腎勻漿（w∶v），將漿液3000 g于4℃離心15 min，取上清液分裝，-80℃保存備用。按試劑盒說明書方法測定TAOC、SOD、MDA、GSH-PX、GSH、CP。肝、心、腎組織勻漿蛋白質含量按照Lowry法測定［9］。

1.2.4 數據處理與統計分析 采用SPSS 17.0軟件（SPSS Inc.）進行統計，并以（平均值±標準差）表示，多個樣本均數的比較采用ANOVA檢驗，兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結果與討論

2.1 抗氧化劑對急性酒精引起氧化應激大鼠血清及組織器官T-AOC活性的影響

由圖1可知，與對照組相比，模型組的血清及各組織器官T-AOC活性均極顯著降低（p＜0.01），說明酒精導致的氧化應激損傷模型成功建立。T-AOC活性全面反映體內抗氧化防御系統。AX、VE組與模型組相比，血清、肝、心組織T-AOC活性均無顯著性差異。然而，與模型組相比，單獨服用AX或VE可顯著升高腎組織T-AOC活性（p＜0.05）。說明AX與VE對酒精引起的氧化應激損傷有保護作用但不明顯。AXVE組與模型組相比，可顯著升高血清T-AOC活性（p＜0.05），顯著升高肝、心組織T-AOC活性（p＜0.05），極顯著升高腎組織T-AOC活性（p＜0.01）。AXVE組與對照組相比，血清T-AOC活性顯著降低（p＜0.05）。由結果可知，與單一AX或VE相比，AXVE組對酒精引起的氧化損傷具有更有效的潛在治療作用。

圖1 抗氧化劑對大鼠T-AOC活性的影響Fig.1 Effect of antioxidants on the T-AOC activity in rats

2.2 抗氧化劑對急性酒精引起氧化應激大鼠血清及組織器官SOD活性的影響

由圖2可知，與對照組相比，模型組的血清及各組織勻漿SOD活性均極顯著降低（p＜0.01），說明酒精導致的氧化應激損傷模型成功建立。SOD是生物體內重要的抗氧化酶類，它的含量高低反映體內氧化應激水平。AX、VE組與模型組相比，可顯著升高血清及肝、心組織SOD活性（p＜0.05）。AX、VE組與模型組相比，腎組織SOD活性無顯著性差異。說明AX與VE對升高酒精引起的氧化應激損傷大鼠SOD水平有一定作用。AXVE組與模型組相比，可極顯著升高血清及肝、心、腎組織SOD活性（p＜0.01）。結果表明，與單一AX或VE相比，AXVE聯用可明顯恢復或緩解急性酒精導致SOD活性劇變，有利于保持氧化與抗氧化系統的平衡。

圖2 抗氧化劑對大鼠SOD的影響Fig.2 Effect of antioxidants on the SOD activity in rats

2.3 抗氧化劑對急性酒精引起氧化應激大鼠血清及組織器官MDA含量的影響

由圖3可知，與對照組相比，模型組血清及組織MDA含量均極顯著升高（p＜0.01），說明酒精導致的氧化應激損傷模型成功建立。MDA反映生物體內內源性脂質過氧化物及過氧化物水平。AX組與模型組相比，顯著降低血清與肝、心組織MDA含量（p＜0.05）。VE組與模型組相比，血清MDA含量顯著降低（p＜0.05），心組織MDA含量顯著降低（p＜0.05），肝、腎組織MDA含量無顯著性差異。說明AX與VE對降低酒精引起的氧化應激損傷大鼠MDA水平作用不明顯。AXVE與模型組相比，可極顯著降低血清與肝、心、腎組織MDA含量（p＜0.01）。結果顯示，相比單獨使用AX或VE，AXVE聯用更能有效調節由急性酒精導致體內組織急劇升高的MDA含量變化。

圖3 抗氧化劑對大鼠MDA含量的影響Fig.3 Effect of antioxidants on the MDA content in rats

2.4 抗氧化劑對急性酒精引起氧化應激大鼠血清及組織器官GSH-Px活性的影響

由圖4可知，與對照組相比，模型組的血清及組織GSH-Px活性均極顯著降低（p＜0.01），說明酒精導致的氧化應激損傷模型在本研究中已成功建立。AX組與模型組相比，血清與心組織GSH-Px活性顯著升高（p＜0.05），腎組織GSH-Px活性極顯著升高（p＜0.01）。說明AX可提高酒精引起的氧化應激損傷大鼠GSHPx活性。VE組與模型組相比，血清與肝、心、腎組織GSH-Px活性均無顯著性差異。說明VE不能提高酒精引起的氧化應激損傷大鼠GSH-Px活性。AXVE與模型組相比，血清與肝、腎組織GSH-Px活性極顯著升高（p＜0.01），心組織GSH-Px活性顯著性升高（p＜0.05）。說明AXVE聯用可提高酒精大鼠組織內GSHPx活性。

圖4 抗氧化劑對大鼠GSH-Px活性的影響Fig.4 Effect of antioxidants on the GHS-Px activity in rats

2.5 抗氧化劑對急性酒精引起氧化應激大鼠血清及組織器官GSH活性的影響

由圖5可知，與對照組相比，模型組的血清及組織GSH活性均極顯著降低（p＜0.01），說明酒精導致的氧化應激損傷模型成功建立。AX組與模型組相比，心組織GSH活性顯著升高（p＜0.05）。說明AX對酒精引起的氧化應激損傷大鼠GSH活性無影響。VE組與模型組相比，血清與肝、心、腎組織GSH活性無顯著性差異。說明VE對酒精引起的氧化應激損傷大鼠GSH活性無影響。AXVE與模型組相比，血清與心、腎組織GSH活性極顯著升高（p＜0.01），肝組織GSH活性顯著性升高（p＜0.05）。結果表明，較單一AX或VE，聯用可更有效恢復急性酒精引起的GSH活性變化。

圖5 抗氧化劑對大鼠GSH活性的影響Fig.5 Effect of antioxidants on the GHS activity in rats

2.6 抗氧化劑對急性酒精引起氧化應激大鼠血清及組織器官CP含量的影響

由圖6可知，與對照組相比，模型組的血清及組織CP含量均極顯著升高（p＜0.01），說明酒精導致的氧化應激損傷模型成功建立。AX、VE組與模型組相比，血清與肝、心、腎組織CP含量無顯著性差異。說明AX與VE并不能降低酒精引起的氧化應激損傷大鼠CP含量。AXVE與模型組相比，可極顯著降低血清CP含量（p＜0.01），顯著性降低肝、心、腎CP含量（p＜0.05）說明AXVE聯用可降低酒精導致的CP含量升高，其調節作用在血清和心組織內尤為突出。

圖6 抗氧化劑對大鼠CP含量的影響Fig.6 Effect of antioxidants on the CP content in rats

3 討論

蝦青素作為一種廣泛存在于生物及植物體內的物質，其抗氧化作用很可能保護乙醇氧化應激造成的損傷。酒精中毒會導致人或動物代謝紊亂，氧化應激是酒精誘導細胞損傷的發病重要機制之一［10］。目前研究發現急性酒精對人體損傷很可能是由于體內ROS增多，脂質過氧化及抗氧化酶活性被抑制導致［11］。酒精抑制了生物系統的抗氧化活動，導致自由基積累。MDA與CP是內源性脂質過氧化物及過氧化物的標志，大多數的組織損傷被認為是自由基攻擊生物膜導致的［12］。T-AOC反映了動物機體的抗氧化防御系統，SOD是生物體內重要的抗氧化酶，它體現生物體氧化應激的狀態，反應了生物體內清除自由基的水平和能力［13］。GSH與GSH-Px是生物體內另一種抗氧化劑及自由基清除劑，它可以保護細胞膜結構與功能不受過氧化物損害［14］。有研究證明VE可以降低氧化應激的水平，并可預防心血管疾病等慢性病。蝦青素和VE聯用有很好的效果，其協同作用可有效緩解高脂飲食導致氧化損傷［4］。

本實驗對比蝦青素組、VE組、蝦青素與VE聯用組對急性酒精引起的氧化應激大鼠的影響。為了更好了解各抗氧化劑組對急性酒精引起的氧化損傷的保護作用，對大鼠血清及肝、心、腎組織的MDA水平、蛋白質羥基、GSH及抗氧化酶的活性（T-AOC、SOD、GSH-Px）進行測定。結果發現，急性酒精引起的氧化應激大鼠的T-AOC及GSH、SOD、GSH-Px明顯降低，MDA及CP含量明顯升高，并且單獨服用蝦青素及VE均可提高血清及心、肝、腎組織的T-AOC及GSH、SOD、GSH-Px活性，降低血清及心、肝、腎組織的MDA。此發現可用不同的機制解釋，假設最可能的機制是由于蝦青素的化學結構使它成為很強的抗氧化劑。蝦青素分子是由2羰基和2個羥基基團，和11個共軛烯屬雙鍵組成，形成了共軛多烯系統。有研究結果表明，蝦青素清除ROS機制極大可能是拮抗酒精作用［15］。急性酒精引起生理應激狀態，從而導致細胞水平上一系列不良的影響。氧化應激是ROS生成和抗氧化系統平衡的紊亂，過量ROS生成會導致細胞內大分子（包括脂質、蛋白質、核酸）的損壞。ROS的生成和釋放能夠被多種抗氧化系統（包括酶與非酶抗氧化系統）分解。在線粒體基質內，SOD被看做是第一條抗氧化系統防線，它可以轉化超陰離子為過氧化氫，進而被第二道抗氧化防線GSH-Px代謝。MDA反映了脂質過氧化物含量。在病理狀態下，過量ROS的產生會損害細胞結構，抑制正常的生理功能，因此，在氧化應激下，增強抗氧化防御系統活力是一種保護機制。進一步研究表明，VE與蝦青素有聯合作用，可以避免生物膜氧化損傷［4］。這種聯合作用表現在蝦青素與VE聯用組比單一給藥組對血清及組織抗氧化活性指標的改善更為顯著。口服蝦青素與VE抗氧化劑能夠有效激活體內酶與非酶系統，從而抑制或延遲了細胞和組織的氧化。實驗結果表明，通過對比血清及心、肝、腎組織中的T-AOC及GSH、SOD、GSH-Px活性，血清及心、肝、腎組織中的MDA與CP含量，蝦青素與VE聯用組較單一抗氧化劑組顯著緩解急性酒精引起的氧化應激大鼠的損傷。本實驗結果與以往研究發現相符。

4 結論

本研究結果表明，急性酒精異常提高氧化應激，降低胞外抗氧化物酶活力。通過蝦青素與VE聯用可以增強抗氧活力，最終減緩或提高自由基降解水平，減少ROS和脂質過氧化物。此外結果還表明T-AOC、SOD和GSH-Px活力有效恢復，進一步闡明蝦青素與VE聯用是通過降低ROS和脂質過氧化物來調節氧化與抗氧化的平衡，最終緩解酒精引起的氧化應激損傷。另外，Ghlissi Z等報道，蝦青素與VE聯用較單一抗氧化劑恢復組更有效緩解高脂飲食導致氧化損傷，并進一步改善認知功能障礙［4］。由此推論，蝦青素與VE聯用很可能具有協同作用，與單一抗氧化劑相比具有更強的抗氧化性，并對急性酒精引起的氧化應激具有明顯的保護效果。本實驗為相關功能食品或藥品的開發提供了重要理論依據。然而，蝦青素與VE聯用的量效關系與作用機理還有待進一步研究。

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Effect of astaxanthin combined with vitamin E on acute alcohol-induced oxidative stress in rats

BAI Yun
（Hulunbeier Vocational Technical College，Hulunbeier 021000，China）

The present study was conducted to investigate the combination effects of astaxanthin（AX）combined with vitamin E on reversing acute alcohol-induced oxidative stress in rats.Total 50 male Wistar rats were selected and randomly divided into control group（n=10），model group（n=10），AX group（n=10，0.6 g·kg-1·d-1），VEgroup （n=10，0.2 g·kg-1·d-1）and AXVE（0.3，0.1 g·kg-1·d-1）group（n=10）.Following a 30 consecutive with antioxidative drugs treatment，model group，AX group，VEgroup and AXVE group（n=10）oral received a single dose of alcohol（12 mL·kg-1）12 hours after the last treatment.Anti-oxidative indices of serum and organs samples were collected and detected 6 hour after alcohol treatment.In comparison with model group，AX，VEand the combination reagents of AX and VEenhanced the activities of the total anti-oxidative capacity（TAOC），glutathione（GSH），superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）from serum，heart，liver and kidney samples，while inhibited the malondialdehyde（MDA）levels in the serum，heart，liver and kidney，with a predominant effects of complex treatment.The findings indicated that compared to treatment of AX or VEalone，AX combined with VEtogether mitigated oxidative damage effectively which induced by acute alcohol exposure.It might due to the synergistic actions of AX combined with VE.

astaxanthin；vitamin E；acute alcohol exposure；oxidative stress；rats

TS254.9

A

1002-0306（2016）02-0362-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.065

2015－06－12

白云（1972-），女，碩士，高級講師，研究方向：食品加工與安全，E-mail：274923871@qq.com。