蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對(duì)糖尿病SD大鼠腎臟的保護(hù)作用

董 媛，郭 健，李 艷，王 皓，劉 磊，朱 潔，王會(huì)巖（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對(duì)糖尿病SD大鼠腎臟的保護(hù)作用

董 媛，郭 健，李 艷，王 皓，劉 磊，朱 潔，王會(huì)巖*
（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

本文通過(guò)鏈脲佐菌素建立早期糖尿病腎病大鼠模型，考察蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物高劑量組（2 g/kg·d、中劑量組（0.5 g/kg·d）和低劑量組（0.05 g/kg·d）灌胃給藥3周后，對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，Cs-4高劑量組能夠緩解糖尿病大鼠體重的下降（p＜0.05），降低血糖、尿糖和尿微量白蛋白排泄率（p＜0.01）；對(duì)腎功能檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果表明，Cs-4能顯著降低血清尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、肌酐含量（p＜0.01），同時(shí)提高血清超氧化物轉(zhuǎn)化酶（SOD）活力（p＜0.01），丙二醛（MDA）含量明顯減少（p＜0.01）。腎臟組織切片HE染色結(jié)果也表明，Cs-4給藥后，腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯減少，說(shuō)明Cs-4提取物能夠很好的抗糖尿病和保護(hù)腎臟損傷。

蝙蝠蛾擬青霉，Cs-4，鏈脲佐菌素，糖尿病腎病

蝙蝠蛾擬青霉（Paccilomyces hepiali），是冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型，從野生的冬蟲(chóng)夏草子座分離得來(lái)［1］，收錄于2010版《中國(guó)藥典》［2］。其主要成分包括多糖、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素、維生素等［3］，發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)、軟化血管、鎮(zhèn)咳等多種功效［4］。現(xiàn)代藥理研究還發(fā)現(xiàn)蝙蝠蛾擬青霉Cs-4發(fā)酵菌粉可調(diào)節(jié)血脂［5］，對(duì)鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）所致大鼠糖尿病有明顯降低血糖的作用［6］。臨床上已經(jīng)用于糖尿病的輔助治療［7］。但是其對(duì)糖尿病患者腎臟的保護(hù)作用還不是很明確。糖尿病腎病（DiabetesNephropathy，DN）是糖尿病常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥，其病因是腎組織中過(guò)多的葡萄糖積累，已成為糖尿病死亡的主要原因之一［7］。早期DN是治療的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)患者表現(xiàn)為腎功能不全，但尚未達(dá)到透析治療的程度，目前仍然缺乏有效的治療手段和藥物［8］。本研究采用STZ誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病早期腎病模型，考察蝙蝠蛾擬青霉菌粉Cs-4對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝙蝠蛾擬青霉Cs-4菌粉 購(gòu)買(mǎi)于江蘇神華藥業(yè)有限公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD（Sprague Dawley）大鼠，清潔級(jí)，體重180～220 g，雄性，合格證號(hào)為SCXK-（吉）2013-0003，由長(zhǎng)春生物制品研究所提供；鏈脲佐菌素（STZ）等 Sigma；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿酸（uric acid，UA）、葡萄糖、肌酐、尿微量白蛋白測(cè)定試劑盒 購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

DHP-908型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒儀器有限公司；ELX800型酶標(biāo)儀 美國(guó)BIOTEK公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物制備 依據(jù)文獻(xiàn)［9］制備Cs-4提取物。準(zhǔn)確稱取100 g蝙蝠蛾擬青霉Cs-4菌粉熱水浸提，在溫度80℃，料液比1∶50條件下，提取2次，每次提取時(shí)間3 h，1500 r/min離心，合并上清，減壓濃縮后，所得浸膏即為水提粗提物（WE），置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫o藥前用適當(dāng)生理鹽水稀釋至所需濃度，灌胃給藥。

1.2.2 蝙蝠蛾擬青霉成分分析 依照文獻(xiàn)［10］方法定性分析WE中化學(xué)成分的種類，對(duì)可能的活性物質(zhì)進(jìn)行初步鑒定。鑒定項(xiàng)目包括：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、還原糖、糖類、鞣酸、酚類、生物堿類、甾醇類、環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸、油、揮發(fā)油、蒽醌類、黃酮類、香豆素和內(nèi)酯類化合物。

1.2.3 STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型的建立及分組 健康SD大鼠，禁食不禁水12 h，連續(xù)3次腹腔注射2%STZ，注射劑量為30 mg/kg·d。注射后3 h灌胃含25%葡萄糖0.8 mL/200 g；末次注射后尾靜脈采血，測(cè)空腹血糖，以血糖值≥11.1 mmol/L者作為糖尿病模型大鼠，喂養(yǎng)4周后，尿糖定性為（+++），尿微量白蛋白排泄率＞30 mg/24 h者為早期糖尿病腎病模型造模成功［11］。正常對(duì)照組注射等體積檸檬酸緩沖液（pH4.3）。將造模成功的大鼠按體重及血糖分為模型對(duì)照組、鹽酸二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組（Met，120 mg/kg·d）、提取物高劑量組（2 g/kg·d）、中劑量組（0.5 g/kg·d）和低劑量組（0.05 g/kg·d），每組10只。

1.2.4 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對(duì)大鼠糖尿病腎病的治療作用研究 連續(xù)灌胃給藥21 d，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量生理鹽水，分別于給藥第0、10、21 d，稱重，收集24 h尿液，依照文獻(xiàn)［11］測(cè)定尿糖和微量白蛋白排泄率，并尾靜脈取血，測(cè)定血清中空腹血糖濃度。末次給藥后，尾靜脈取血，測(cè)定血清SOD活力、MDA含量、BUN、UA、肌酐含量，測(cè)定方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。脫臼處死大鼠后，收集腎臟，4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片，HE染色觀察進(jìn)行病理分析［12］。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD表示。運(yùn)用軟件Origin 8.5統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。應(yīng)用t檢驗(yàn)法分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間是否存在顯著差異，p≤0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 WE成分鑒定

熱水浸提法提取的是Cs-4菌絲體中的水溶性物質(zhì)，通過(guò)化學(xué)顯色反應(yīng)，可以初步判定Cs-4水提物中成分的種類。結(jié)果如表1所示，Cs-4水提物中含有蛋白質(zhì)、多糖和有機(jī)酸類。這與2010版《中國(guó)藥典》中冬蟲(chóng)夏草的主要成分一致。

表1 粗提物化學(xué)成分初步分析結(jié)果Table1 Summary of preliminary chemical analysis of crude extracts

2.2 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對(duì)大鼠糖尿病腎臟的保護(hù)作用

表2 給藥期間各組糖尿病大鼠的體重和空腹血糖結(jié)果（平均值±SD，n=10）Table2 Bodyweight and fasting blood glucose of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.1 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對(duì)糖尿病大鼠體重等指標(biāo)的影響 糖尿病病癥有“三多一少”現(xiàn)象，為了考察Cs-4提取物的抗糖尿病腎病作用，采用STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病腎病模型，監(jiān)測(cè)糖尿病大鼠給藥3周期間的體重、尿糖、尿微量白蛋白排泄率和空腹血糖，結(jié)果如表2～表3所示。模型組建模后4項(xiàng)指標(biāo)均與正常組存在顯著差異（p＜0.01），說(shuō)明造模成功。經(jīng)過(guò)3周給藥后，Cs-4高劑量組能夠緩解糖尿病導(dǎo)致的大鼠體重減輕（p＜0.05），血糖下降54.8%，尿糖和微量白蛋白排泄率也明顯降低（p＜0.01），和陽(yáng)性對(duì)照組效果相當(dāng)；中劑量組與模型組相比，血糖、尿糖和微量白蛋白排泄率減少（p＜0.05），低劑量組和模型組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異（p＞0.05）。

表3 給藥期間各組糖尿病大鼠的尿糖和24 h微量白蛋白排泄率結(jié)果（平均值±SD，n=10）Table3 Urine sugar and urinary albumin excretion rate in 24 h of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.2 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對(duì)糖尿病大鼠腎功能的影響 經(jīng)Cs-4提取物治療3周后，各組糖尿病大鼠血清中的BUN、UA和肌酐含量結(jié)果如表4所示。模型組腎功能損傷明顯，與正常組相比，BUN、UA、肌酐含量存在顯著差異（p＜0.01）。通過(guò)Cs-4提取物給藥后，各項(xiàng)腎功能指標(biāo)均有所降低，其中高劑量組治療效果最佳，與陽(yáng)性對(duì)照藥接近，與模型組存在顯著差異（p＜0.01）。中劑量組與模型組相比，BUN降低（p＜0.01），UA和肌酐含量也有所降低（p＜0.05）。低劑量組和模型組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異（p＞0.05）。

表4 給藥期間各組糖尿病大鼠腎功能檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果（平均值±SD，n=10）Table4 Renal function tests of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.3 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對(duì)糖尿病大鼠抗氧化能力的影響 SOD能清除體內(nèi)自由基，而MDA則是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，二者能夠反映出機(jī)體清除自由基的能力。糖尿病患者長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，會(huì)增加體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，本實(shí)驗(yàn)考察了糖尿病大鼠SOD和MDA兩項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果如表5所示。經(jīng)Cs-4提取物給藥后，高劑量組大鼠血清SOD水平明顯提高，MDA含量也明顯降低，與模型組相比存在顯著差異（p＜0.01）；中劑量組與模型組相比，MDA含量也有所降低（p＜0.05），SOD水平有所提高（p＜0.05）。低劑量組和模型組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異（p＞ 0.05）。說(shuō)明中劑量和高劑量的Cs-4提取物能夠增強(qiáng)大鼠抗氧化能力。

表5 給藥期間各組糖尿病大鼠抗氧化水平檢測(cè)結(jié)果（平均值±SD，n=10）Table5 Antioxidant levels of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.4 腎臟組織切片分析 各組大鼠腎臟組織切片如圖1所示。正常對(duì)照組（圖1A）大鼠的腎臟腎小球在切片上呈圓形，無(wú)明顯增大或縮小，系膜無(wú)增生，腎小管無(wú)萎縮。模型組糖尿病大鼠有典型的早期糖尿病腎病癥狀，腎小球、腎小管萎縮，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎系膜增生（圖1B）。經(jīng)過(guò)Cs-4治療3周后，從切片結(jié)果看，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯好轉(zhuǎn)，說(shuō)明Cs-4對(duì)糖尿病腎病有一定的緩解作用。

圖1 糖尿病大鼠腎組織切片HE染色分析（×200）Fig.1 Histopathological analysis in l kidney collected from all experimental rats through HE staining（×200）

3 結(jié)論

冬蟲(chóng)夏草作為傳統(tǒng)的中藥，在我國(guó)使用已有悠久的歷史。本文研究了冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型蝙蝠蛾擬青霉對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，與模型組相比，Cs-4提取物，尤其是高劑量組可明顯降低糖尿病大鼠的空腹血糖、尿糖的含量，增加大鼠體重，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，還能夠明顯降低糖尿病大鼠尿微量白蛋白排泄率，降低大鼠血清中BUN、UA和肌酐含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明其能改善糖尿病大鼠腎功能。抗氧化水平結(jié)果顯示，Cs-4可提高血清SOD水平，降低MDA水平，表明其能提高大鼠抵抗自由基的能力。切片結(jié)果顯示，與糖尿病模型組相比，Cs-4高劑量組能緩解炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，顯示蝙蝠蛾擬青霉對(duì)糖尿病大鼠腎臟有良好的保護(hù)作用。但本研究也存在許多局限，如沒(méi)有對(duì)蝙蝠蛾擬青霉保護(hù)腎臟的機(jī)制做進(jìn)一步研究，但仍為其臨床研究提供了基礎(chǔ)，具有巨大的開(kāi)發(fā)空間。

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Study on the anti-diabetic nephropathy activities of Paccilomyces hepiali extract on diabetic sprague-dawley rats

DONG Yuan，GUO Jian，LI Yan，WANG Hao，LIU Lei，ZHU Jie，WANG Hui-yan*
（Jilin Medical University，Jilin 132013，China）

This work investigated the anti-diabetic nephropathy activities of Paccilomyces hepialid extract，Cs-4，on STZ-induced diabetic sprague-dawley rats.Sprague-dawley rats were orally administered with water extract at 0.05 g/kg，0.5 g/kg and 2 g/kg for 3 weeks，respectively.Then，related biochemical indexes were determined.Data showed that similar as metformin，the high dose group of Paccilomyces hepiali extract could improve the body weight loss caused by diabetes（p＜0.05），and displayed a significant reduction in fasting blood glucose，urine glucose and urinary albumin excretion rate（p＜0.01）.Meanwhile，renal function tests showed that Paccilomyces hepiali extract displayed a significant reduction in BUN，UA and creatinine（p＜0.01）.The serum SOD activity was enhanced（p＜0.01）and the MDA level was decreased（p＜0.01）.Pathological morphology reversion in histopathological sections showed that inflammatory cell infiltration was significantly reduced after treatment which confirmed that Cs-4 presents excellent anti-diabetic and anti-nephropathic activities.

Paccilomyces hepiali；Cs-4；STZ；diabetic nephropathy

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0358-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.064

2015－05－29

董媛（1986-），女，博士，講師，研究方向：食藥用真菌研究，E-mail：dongyuan19860910@126.com。

*通訊作者：王會(huì)巖（1968-），女，博士，副教授，研究方向：生物技術(shù)制藥，E-mail：zswhy518@163.com。

吉林市科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（20156430）。