響應面法優化微波輔助提取平臥菊三七三萜的工藝研究

葉芝紅，趙 艷，朱艷萍，鄭國棟（江西農業大學食品科學與工程學院江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西南昌330045）

響應面法優化微波輔助提取平臥菊三七三萜的工藝研究

葉芝紅，趙 艷，朱艷萍，鄭國棟*
（江西農業大學食品科學與工程學院江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西南昌330045）

本文研究了用微波輔助提取平臥菊三七三萜的工藝。考察乙醇濃度、微波時間、微波功率、提取溫度和料液比等因素對平臥菊三七三萜提取得率的影響。在單因素實驗基礎上利用Box-Behnken實驗設計方法和響應面分析法，確定其最佳提取工藝條件。實驗結果表明，當乙醇濃度90%和微波功率600 W時，微波輔助提取平臥菊三七三萜的最佳提取條件為：微波時間8.6 min、提取溫度57.7℃、料液比1∶33 g/mL。在此條件下平臥菊三七三萜的提取率為2.13%，與模型預測值2.14%之間具有良好的擬合性。

平臥菊三七，三萜，微波輔助提取，響應面優化

平臥菊三七（Gynura procumbens）是一種多年生菊科三七屬植物，又名續命草、神仙草，生于林間溪旁坡地砂質土上，攀援于灌木或喬木上，主要分布于東南亞及我國南部和西南部地區［1］。2012年5月平臥菊三七被國家衛生部批準為新資源普通食品，近年來在江西省靖安、豐城和都昌等地通過無性繁殖等技術進行了大面積人工栽培，是一種比較容易開發和應用潛力很大的食物。三萜化合物多數是一類基本母核由30個碳原子組成的萜類化合物，其結構是由六個異戊二烯單體聚合而成。三萜化合物在自然界種類繁多，分布廣泛，大多為四環三萜和五環三萜，少數有鏈狀、單環和三環等結構［2］。三萜化合物具有抗癌、抑菌、抗腫瘤、降糖、降脂等廣泛的生理活性［3-7］。

研究表明平臥菊三七含有豐富的黃酮類、多糖類、綠原酸、多不飽和脂肪酸等多種生物功能活性因子［8-10］，國內外藥理研究表明其及其粗提物具有降壓、降糖、降脂、抗菌等功效［11-14］。然而平臥菊三七提取三萜還未見報道，本研究以平臥菊三七為原料，采用響應面設計分析法對微波輔助提取三萜化合物工藝進行優化，以期獲得較高的提取得率，為后續平臥菊三七活性物質的研究和利用提供實驗基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平臥菊三七 采自江西農業大學中藥園，清洗曬干粉碎過60目篩；齊墩果酸標準品 成都曼思特生物科技有限公司；無水乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等試劑 均為分析純級。

XH-100B電腦微波催化合成萃取儀 北京祥鵠科技發展有限公司；V5600型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；TDL-5-A低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；HH-60數顯恒溫磁力攪拌循環水箱 常州市國華電力儀表設備有限公司；JSP-200粉碎機 浙江省永康市金穗機制造廠；QT-2漩渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 齊墩果酸標準曲線的繪制 參照孟憲軍［15］的方法。檢測標準曲線的繪制過程如下：稱取一定量的齊墩果酸標準品，用無水乙醇溶解后配成0.15 mg/mL的齊墩果酸標準溶液，精確吸取溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL，分別加入試管中，首先將所有試管置于水浴鍋中加熱揮盡乙醇溶劑，然后分別加入新制的5%香草醛-冰乙酸0.40 mL和高氯酸1.0 mL，利用渦流混合器迅速混勻后將試管置于60℃水浴中加熱15 min，取出流水冷卻至室溫，加5.0 mL冰醋酸，迅速混勻溶液，靜置15 min，在547 nm處測定吸光值，以吸光度為縱坐標，齊墩果酸質量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 平臥菊三七三萜類化合物提取 稱取平臥菊三七粉末1 g，加入一定濃度的乙醇溶液提取劑，在一定的溫度、一定提取時間和一定的微波功率條件下進行微波輔助提取，將不同條件下處理得到的提取液進行離心（3500 r/min，15min），得到平臥菊三七三萜的待測液，每份樣液分別取上清液0.20 mL置于試管中，在恒溫水浴鍋中沸水浴揮干溶劑，然后分別加入新制的5%香草醛-冰乙酸0.40 mL和高氯酸1.0 mL，利用渦流混合器迅速混勻后將試管置于60℃水浴中加熱15 min，取出流水冷卻至室溫，加5.0 mL冰醋酸，迅速混勻溶液，靜置15 min，在547 nm處測定吸光值，根據標準曲線計算平臥菊三七三萜的提取得率，計算公式如下：

1.2.3 單因素實驗設計 以平臥菊三七三萜提取得率為指標，在固定其他實驗條件的情況下，分別考察乙醇濃度、微波時間、微波功率、提取溫度和料液比對三萜提取得率的影響。

1.2.3.1 乙醇濃度對平臥菊三七三萜提取得率的影響 按1.2.2的操作方法，在微波時間8 min，微波功率600 W，提取溫度60℃，料液比1∶30 g/mL的條件下，分別考察乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%、95%對平臥菊三七三萜提取得率的影響。

1.2.3.2 微波時間對平臥菊三七三萜提取得率的影響 按1.2.2的操作方法，在乙醇濃度90%，微波功率600 W，提取溫度60℃，料液比1∶30 g/mL的條件下，分別考察微波時間為2、4、6、8、10、12 min對平臥菊三七三萜提取得率的影響。

1.2.3.3 微波功率對平臥菊三七三萜提取得率的影響 按1.2.2的操作方法，在乙醇濃度90%，微波時間8 min，提取溫度60℃，料液比1∶30 g/mL的條件下，分別考察微波功率為300、400、500、600、700、800 W對平臥菊三七三萜提取得率的影響。

1.2.3.4 提取溫度對平臥菊三七三萜提取得率的影響 按1.2.2的操作方法，在乙醇濃度90%，微波時間8 min，微波功率600 W，料液比1∶30 g/mL的條件下，分別考察提取溫度為30、40、50、60、70、80℃對平臥菊三七三萜提取得率的影響。

1.2.3.5 料液比對平臥菊三七三萜提取得率的影響

按1.2.2的操作方法，在乙醇濃度90%，微波時間8 min，微波功率600 W，提取溫度60℃的條件下，分別考察料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL對平臥菊三七三萜提取得率的影響。

1.2.4 響應面法優化平臥菊三七三萜提取實驗 在單因素實驗的基礎上優化實驗條件，選擇微波時間、提取溫度和料液比為自變量，運用Design Expert 6.0.1軟件按照Box-Behnken設計方法進行3因素3水平的響應曲面法分析，并對數據進行多項式回歸分析，建立二次響應回歸模型，擬合二次回歸方程，得到微波輔助提取三萜的最佳工藝參數。實驗設計方案見表1。

表1 響應曲面法實驗因素水平編碼表Table1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3 數據處理

單因素中均取3次平行實驗的平均值進行分析作圖，采用OriginPro 8.5軟件作圖；響應面優化實驗的數據用Design-expert 6.0.1軟件分析處理。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

齊墩果酸標準溶液中齊墩果酸的質量與吸光度擬合的回歸方程：A=0.0083m+0.0057，R2=0.9993。結果表明，齊墩果酸在質量為0.015～0.105 mg時與其吸光度線性關系良好。

2.2 單因素實驗結果分析

2.2.1 乙醇濃度對平臥菊三七三萜提取得率的影響

由圖1可知，隨著乙醇濃度的升高，三萜的提取得率逐漸增加后降低，當90%時，三萜得率最高，根據極性的相似相容原理，表明在90%的乙醇溶液極性是最適合提取，且提取效果最好。

2.2.2 微波時間對平臥菊三七三萜提取得率的影響

由圖2可知，在微波時間2～8 min間，隨著微波時間的延長三萜的提取得率增大；在8 min后，提取得率迅速下降。原因可能是當微波時間過長時，會造成三萜結構的破壞或者是其活性成分的損失因而造成三萜得率的下降［16］，因此選取的最佳微波時間8 min。

圖1 乙醇濃度對平臥菊三七三萜提取得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

圖2 微波時間對平臥菊三七三萜提取得率的影響Fig.2 Effect of microwave time on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.2.3 微波功率對平臥菊三七三萜提取得率的影響由圖3可知，隨著微波功率的升高，三萜的提取得率逐漸提高，當微波功率大于600 W后其上升的幅度較小，從提取效果和后續處理能耗等方面考慮，選取微波功率600 W為宜。

圖3 微波功率對平臥菊三七三萜提取得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.2.4 提取溫度對平臥菊三七三萜提取得率的影響

由圖4可知，不同的提取溫度對三萜提取得率的影響不同，三萜的提取得率隨著溫度的升高先增大后減小，當溫度為60℃時提取得率最大。所以提取溫度為60℃提取效果最好。

圖4 提取溫度對平臥菊三七三萜提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.2.5 料液比對平臥菊三七三萜提取得率的影響

由圖5可知，三萜的提取得率隨著料液比的增大呈現先增大后減小的趨勢，在1∶30 g/mL時達到最大值，這主要是因為在一定范圍內當溶液體積增大時，三萜溶解的更多。但是當溶劑含量過大時，溶劑對微波的能量吸收增加，導致細胞液對微波能量的吸收減少，造成細胞破壁不完全，細胞內容物質不能充分溶出，從而使其含量出現下降趨勢。

圖5 料液比對平臥菊三七三萜提取得率的影響Fig.5 Effect of different soild-liquid ratio on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.3 響應面法優化實驗結果

2.3.1 建立模型 在單因素實驗結果的基礎上，根據Box-Behnken組合設計原理，以三萜提取得率為響應值（Y），利用Design Expert 6.0.1軟件設計了3因素3水平的響應面實驗，對三萜的提取條件進行優化，共進行17個實驗點，其中包含12個析因點和5個零點實驗，12個析因點實驗用以考察微波時間、提取溫度、料液比3個因素對微波提取三萜含量的影響是否顯著，5次零點實驗用作誤差估計。實驗設計和結果見表2。

2.3.2 方差分析與顯著性檢驗 利用軟件對實驗結果進行二次多項式回歸擬合，對表2的數據進行方差分析后得到模型的二次多項式回歸方程如下：

表2 響應面實驗設計方案與結果Table2 Test design and results of RSM

表3 方差分析與顯著性檢驗Table3 The variance analysis and significance test

從表3回歸方差分析結果表明，響應面的回歸模型極顯著（p＜0.0001）；模型的失擬項不顯著（p= 0.4351＞0.05），說明該模型對本實驗擬合較好。從表3還可以看出因素一次項X1、X2、X3和二次項X、X、X即微波時間、提取溫度和料液比對實驗結果的影響極顯著（p＜0.05），而各因素交互項X1X2、X1X3、X2X3對實驗結果的影響不顯著（p＞0.05），即微波時間、提取溫度和料液比之間交互作用不顯著。

2.3.3 響應面分析與優化 根據回歸方程繪制響應曲面圖和等高線圖，分析微波時間、提取溫度和料液比等因素及其交互作用對微波輔助提取三萜得率的影響。結果見圖6～圖8。

圖6 三萜提取得率=f（X1，X2）響應曲面圖（X3=1∶30 g/mL）Fig.6 The yield of triterpenoids in Gynura procumbens=f（X1，X2）response surface plot（X3=1∶30 g/mL）

圖7 三萜提取得率=f（X1，X3）響應曲面圖（X2=60℃）Fig.7 The yield of triterpenoids in Gynura procumbens=f（X1，X3）tesponse surface plot（X2=60℃）

圖8 三萜提取得率=f（X2，X3）響應曲面圖及等高線圖（X1=8 min）Fig.8 The yield of triterpenoids in Gynura procumbens=f（X2，X3）response surface plot（X1=8 min）

通過響應面的坡度陡峭程度和等高線圖橢圓形狀可以直觀反映出兩個因素交互作用的強弱程度，如果響應面坡度相對平緩說明因素間的交互效應弱，即當實驗條件改變時其對響應值影響不大；反之，如果響應面坡度非常陡峭說明因素間的交互作用強，即當實驗條件有變異時響應值會差異較大。等高線呈橢圓形表示兩個因素交互作用顯著，而等高線接近圓形表示交互作用不顯著。故由圖6～圖8可知，微波時間和提取溫度、微波時間和料液比以及提取溫度和料液比的交互作用都不顯著，與上述方差分析和顯著性檢驗相符。

2.3.4 驗證實驗 通過Design Expert 6.0.1軟件對優化后的回歸方程分析，在各個實驗因素水平范圍內微波輔助提取三萜的最佳參數為：微波時間8.59 min、提取溫度57.64℃、料液比1∶32.78 g/mL，在此最佳工藝條件下平臥菊三七三萜的最大提取得率為2.14%。

為了驗證回歸模型的有效性，結合實驗所得的最佳工藝條件和實際操作的可行性，選擇在微波時間8.6 min，提取溫度57.7℃，料液比1∶33 g/mL的條件下，進行3次重復驗證性實驗，分別是2.13%、2.12%、2.14%，實際平均得率為2.13%，與預測值2.14%較接近。結果表明該模型是合理有效的，微波輔助提取有效的對三萜提取工藝進行了優化。

3 結論

本文在單因素實驗結果的基礎上以三萜的提取得率為衡量指標，采用響應面分析法研究微波輔助提取三萜的工藝參數，得到最佳工藝條件為微波時間8.6 min，提取溫度57.7℃，料液比1∶33 g/mL，在此條件下平臥菊三七三萜的平均提取率為2.13%。

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Optimization of microwave-assisted extraction of triterpenoids from Gynura procumbens by response surface methodology

YE Zhi-hong，ZHAO Yan，ZHU Yan-ping，ZHENG Guo-dong*
（Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food，College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

To optimize technological parameters for mircrowave-assisted extraction yield of total triterpenoids from Gynura procumbens.The experiments investigated the effects of extraction，such as ethanol concentration，extraction time，microwave power，temperature，and ratio of solid to liquid.Further，the experiments were optimized using a Box-Behnken method of test design and response surface methodology on the basis of the single factor experiment.When the ethanol concentration was 90%and microwave power was 600 W，the optimal extraction conditions were as follows:extraction time was 8.6 min，temperature was 57.7℃and ratio of solid to liquid was 1∶33 g/mL.Under these conditions，the extraction yield of total triterpenoids from Gynura procumbens was up to 2.13%，which was well matched with predicted yield 2.14%.

Gynura procumbens；triterpenoids；mircrowave-assisted extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2016）02-0291-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.050

2015－05－29

葉芝紅（1990-），女，碩士研究生，研究方向：天然產物的分離提取，E-mail：18770051363@163.com。

*通訊作者：鄭國棟（1969-），男，博士，副教授，研究方向：天然產物的分離提取和功能食品，E-mail：zrs150716@aliyun.com。

江西省研究生創新專項資金項目（YC2015-S198）。