星點設計-響應面法優化千斤拔黃酮-β-環糊精包合工藝

陳 帥，王慧竹，姜 昆，鐘方麗，*（.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林32022；2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽006）

星點設計-響應面法優化千斤拔黃酮-β-環糊精包合工藝

陳 帥1，2，王慧竹1，姜 昆1，鐘方麗1，*
（1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022；2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽110016）

本研究以優化千斤拔黃酮-β-環糊精包合工藝，并驗證包合物的增溶作用為目的。在預實驗基礎上，利用紅外分光光度法驗證了千斤拔黃酮-β-環糊精包合物的形成，然后采用飽和水溶液法，在單因素實驗基礎上，以包合物得率和包合率總評歸一值為考察指標，采用響應面法優化千斤拔黃酮-β-環糊精包合物的制備工藝。預實驗結果表明千斤拔黃酮-β-環糊精包合物已經形成，響應面實驗顯示包合物的最佳制備工藝條件為：β環糊精與千斤拔黃酮投料比（質量比）5.5∶1、包合溫度43℃、包合時間3.8 h，在此最佳工藝條件下，千斤拔黃酮-β-環糊精包合物的包合率為44.68%，包合物得率為73.12%，溶解度測定結果表明將千斤拔黃酮利用β環糊精包合后，可使千斤拔黃酮在水中溶解度由（22.86±0.62）mg提高到（106.58±0.95）mg。千斤拔黃酮與β環糊精可形成穩定的包合物，包合物的形成可使千斤拔黃酮在水中的溶解度顯著提高，為千斤拔黃酮口服制劑的開發提供了理論依據。

千斤拔黃酮，β環糊精，包合工藝，星點設計，響應面法

千斤拔隸屬于豆科（Leguminosac）蝶形花亞科（Papilionoideae），《中華人民共和國藥典》一部中收載千斤拔為豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis （Merr.et Rolfe）Li、大葉千斤拔Moghania macrophylla （Willd.）O.Kuntze或銹毛千斤拔Moghania ferruginea （Wall.ex Benth.）Li.的干燥根［1］，廣泛分布于我國的東南、中南、西南地區，其中蔓性千斤拔在11個省區均有分布，大葉千斤拔在除湖北、湖南外的9個省區均有分布?！吨兴幋筠o典》記載“千斤拔味甘辛，微苦，性溫平，無毒，具有祛風利濕、消瘀解毒之功效，可治療風濕痹痛，慢性腎炎、跌打損傷、癰腫和喉蛾等癥”［2］。國內外學者對千斤拔化學成分及生物活性的研究報道很多，其化學成分主要含有黃酮類、香豆素類、萜類、揮發油、甾醇類等，其中以黃酮類化合物為主［3-5］，現代藥理研究及臨床實驗表明千斤拔黃酮不僅對各種婦科炎癥有顯著療效，還具有類雌激素作用、良好的抗血栓、抗炎鎮痛、抗氧化的作用，對神經系統的損傷也具有一定的保護作用［6-7］，但千斤拔黃酮（TFF）在水中溶解度差，限制了其在口服制劑中的應用。

β-環糊精（β-CD）是由7個葡萄糖殘基單位以α-1，4-糖苷鍵連接為環形筒狀結構，可將一些體積和形態合適的藥物分子或部分基團借助范德華力包合于其中。難溶性藥物被β-環糊精包合后，能增加藥物的溶解度和溶出速度，改善藥物的吸收和生物利用度等［8-11］。通過檢索文獻未見關于千斤拔黃酮-β-環糊精（TFF-β-CD）包合物的相關報道。為此本文采用飽和水溶液法對制備TFF-β-CD包合物的工藝進行了優化，利用紅外分光光度法對包合物的形成進行了驗證，并對TFF和TFF-β-CD包合物的溶解度進行了測定，以期為TFF在口服制劑中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TFF 吉林化工學院天然產物化學研究室提供，產品符合中華人民共和國藥品標準Ws3-001（Z-001）-98（Z）；β-環糊精 天津市大茂化學試劑廠；其他試劑 均為分析純，蒸餾水自制。

TU-1950型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；Nicolet 6700型傅立葉紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TG-18型高速臺式離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；SHZ-D型循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；AUY220型電子分析天平 日本島津公司；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器 常州邁科諾儀器有限公司；DFZ-6050型真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 TFF線性關系考察 精密稱取干燥至恒重的TFF 10.0 mg置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，制成濃度為0.2 mg·mL-1的TFF對照液，精密移取上述對照液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL TFF對照溶液分別置于10 mL容量瓶中，以60%乙醇溶液定容，搖勻，以60%乙醇溶液為空白對照，采用紫外分光光度法，在339 nm處分別測定吸光度，以質量濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線［12］，得回歸方程為A=8.5038C-0.0054，r=0.9994，線性范圍0.02～0.1 mg·mL-1。

1.2.2 TFF-β-CD包合物的制備 采用飽和水溶液法，按β-CD與TFF投料比（質量比）4∶1分別準確稱取TFF和β-CD適量置燒杯中，TFF用少量60%乙醇溶解，將β-CD在40℃恒溫條件下制成飽和溶液，然后將TFF溶液逐滴加入到β-CD飽和溶液中，在40℃恒溫條件下按既定的時間進行包合，冷卻，置4℃冰箱中冷藏12 h，抽濾，濾餅用少量60%乙醇洗滌3次，60℃真空干燥箱中干燥，即得TFF-β-CD包合物。

1.2.3 TFF-β-CD包合物的驗證 用KBr將TFF、β-CD、TFF和β-CD物理混合物以及按1.2.2項下條件制備的TFF-β-CD包合物壓片，設定測量參數為：掃描范圍4000～650 cm-1，累加掃描次數20，分辨率8 cm-1，分別進行紅外光譜分析，記錄紅外圖譜［13］。

1.2.4 包合物得率與包合率的測定 取1.2.2項下制備的包合物，精密稱重，按式（1）計算包合物的得率（Y2）。

另外精密稱取TFF-β-CD包合物適量（約相當于TFF 32 mg）置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解，定容，搖勻，移取1 mL，置于10 mL容量瓶中，60%乙醇定容，在339 nm處測定樣品吸光度，根據回歸方程求得TFF濃度，從而計算出TFF-β-CD包合物中TFF的含量，按式（2）計算包合率（Y1）。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 投料比對包合物得率和包合率的影響 準確稱取5份TFF原料藥，每份2.0 g，分別以少量乙醇溶解，然后分別按β-CD與TFF投料比（質量比）2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1稱取β-CD置于圓底燒瓶中，加入蒸餾水，在50℃下制成飽和溶液，然后將TFF緩慢加入到飽和溶液中，恒溫條件下攪拌包合3 h，按1.2.2項下方法制備包合物，并根據1.2.1項下方法測定吸光度，計算包合物得率和包合率。

1.2.5.2 包合溫度對包合物得率和包合率的影響 準確稱取5份TFF原料藥，每份2.0 g，分別以少量乙醇溶解，另取5份β-CD，每份12.0 g，置于圓底燒瓶中，加入蒸餾水，分別于30、40、50、60、70℃下制成飽和溶液，然后將TFF緩慢加入到飽和溶液中，攪拌包合3 h，按1.2.2項下方法制備包合物，并根據1.2.1項下方法測定吸光度，計算包合物得率和包合率。

1.2.5.3 包合時間對包合物得率和包合率的影響 準確稱取5份TFF原料藥，每份2.0 g，分別以少量乙醇溶解，另取5份β-CD，每份12.0 g，分別置于圓底燒瓶中，加入蒸餾水，50℃下制成飽和溶液，然后將TFF緩慢加入到飽和溶液中，恒溫條件下分別攪拌包合1、2、3、4、5 h，按1.2.2項下方法制備包合物，并根據1.2.1項下方法測定吸光度，計算包合物得率和包合率。

1.2.6 包合物制備工藝最優參數的確定 以TFF包合物的得率（Y2）和包合率（Y1）為評價指標，在單因素實驗的基礎上，確定β-CD與TFF投料比（X1），包合溫度（X2）及包合時間（X3）作為響應面實驗的自變量，根據星點設計的原理，每個因素設3個水平，用代碼值-1，0，1標識，代碼值所代表的實際物理量如表1所示。

表1 實驗因素水平表Table1 Table of experimental factors and levels

1.2.7 總評值OD的確定 利用SAS 9.4中的design experiment功能進行實驗設計，為了將實驗結果中的包合物的得率（Y2）和包合率（Y1）綜合為一個能反映總體效應結果的值［14］，數據處理采用歸一化法，分別對Y2和Y1按式（3）進行數學轉換，并按式（4）求“歸一值”（OD）：

式中，k表示實驗次數，di（k）表示第i個考察指標項下（Yi）各歸一值，yi（k）表示第i個考察指標項下（Yi）具體數值，（yi）max表示第i個考察指標項下（Yi）各具體數值中最大者，（yi）min表示第i個考察指標項下（Yi）各具體數值中最小者。

1.2.8 TFF-β-CD包合物增溶作用實驗 25℃室溫下，稱取過量的TFF及其包合物各3份，分別置于100 mL容量瓶中，分別精密加入去離子水100 mL，稱定重量，超聲（300 W，50 kHz）溶解2 h，放冷，再稱定重量，去離子水補足減失的重量，12000 r·min-1高速離心10 min，取上清液，0.8 μm微孔濾膜過濾，取續濾液1.0 mL，60%乙醇定容至10 mL，按1.2.1項下方法測定吸光度，按式（5）計算溶解度S，TFF和包合物的溶解度測定實驗各重復6次。

式中，A為吸光度；V1為過濾后定容的溶液體積；V0為溶解樣品的溶液體積。

1.2.9 數據統計分析 利用軟件SPSS 22.0和Origin 8.5對單因素實驗結果進行分析處理，單因素實驗均重復3次。用SAS 9.4軟件對響應面實驗進行設計并處理相關數據，包合物增溶作用實驗結果采用SPSS 22.0進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 包合物驗證結果

利用紅外光譜法對TFF-β-CD包合物的形成進行驗證，結果如圖1所示。

圖1 TFF（a）、β-CD（b）、物理混合物（c）及其包合物（d）的紅外光譜圖Fig.1 IR spectra of TFF（a），β-CD（b），physical mixture（c），and inclusion complex（d）

從圖1可以看出，在譜圖a中，在1605.30 cm-1處存在一個羰基的特征吸收峰，對應著黃酮化合物芳環上的羰基伸縮振動，譜圖c可以看成是TFF（a）和β-CD（b）紅外光譜圖吸收峰的疊加，但峰的吸收相對減弱，羰基的吸收峰位于1610.15 cm-1，譜圖d相比譜圖c有較大差別，其2938.92、2162.73、1980.70、1514.22 cm-1處的吸收峰消失，在2929.06 cm-1位置形成新的吸收峰，并且2359.59、2341.58、1610.15、1441.18 cm-1位置的吸收峰明顯減弱，同時946.88、842.29 cm-1位置的吸收峰有所增強。結果進一步表明了新物相-包合物的形成。

2.2 單因素實驗

2.2.1 投料比對包合物得率和包合率的影響 投料比對包合物得率和包合率的影響結果如圖2所示。

圖2 投料比對包合物得率和包合率的影響Fig.2 Effect of feed ratio on inclusion rate and yield

從圖2可以看出，包合率和得率開始時隨投料比增大而增大，當投料比為4∶1時包合物的包合率和得率均達到最大值，之后隨著投料比的繼續增大，包合率和得率均呈現減小趨勢。其原因可能是當β-CD與TFF投料比較小時，β-CD的量相對于TFF過少，β-CD不足以包裹所有的TFF，當β-CD與TFF投料比較大時，TFF的量相對β-CD較少，也不利于包合，并且β-CD投料量過大，還容易造成原材料的浪費。為了進一步考察投料比對包合率和得率的影響，分別選擇投料比2∶1、4∶1、6∶1進行星點設計-響應面實驗。

2.2.2 包合溫度對包合率和包合物得率的影響 包合溫度對包合率和包合物得率的影響結果如圖3所示。

圖3 包合溫度對包合物得率和包合率的影響Fig.3 Effect of inclusion temperature on inclusion rate and yield

從圖3可以看出，開始階段隨著包合溫度的逐漸升高，包合率和得率逐漸增大，當包合溫度升高至50℃時，包合率和得率均達到最大值，之后隨溫度的繼續升高包合率和得率反而下降，可能是因為β環糊精與TFF包合與脫包合是動態平衡過程，適當的溫度有利于主體分子與客體分子結合成包合物，溫度太低，分子熱運動較緩，包合過程發生較慢，溫度太高則由于分子熱運動加劇，導致包合物脫包合，重新恢復主客體分子單獨運動的狀態。為了進一步考察包合溫度對包合率和得率的影響，選擇40、50、60℃進行星點設計-響應面實驗。

2.2.3 包合時間對包合率和包合物得率的影響 包合時間對包合率和包合物得率的影響結果如圖4所示。

圖4 包合時間對包合率和得率的影響Fig.4 Effect of inclusion time on inclusion rate and yield

從圖4可以看出，包合率和得率隨包和時間的延長逐漸增大，當包合時間為3 h時包合率和得率均達到最大值，之后隨包合時間的繼續延長，包合率略有下降而得率基本不再發生變化，可能是因為包合過程是客體分子進入到主體分子空腔內并以分子間氫鍵結合的過程，包合時間延長有利于主客體分子的充分接觸，有利于包合的形成，但由于包合物形成為一動態過程，過長的時間會導致部分包合物脫包合。為了進一步考察包合時間對包合率和得率的影響，選擇2、3、4 h進行星點設計-響應面實驗。

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 響應面實驗結果 如表2所示。

表2 星點實驗設計及結果Table2 Result of central composite design

2.3.2 響應面分析 對表2中數據進行多元二次回歸擬合，得回歸方程：

利用SAS 9.4軟件對上述擬合方程進行系數顯著性檢驗和方差分析，結果如表3和表4所示。

為了更加直觀表達兩個因素同時對總評值的影響，以回歸方程為分析及預測模型，固定任意一個因素的值為代碼0所對應的實際值，考察其他兩個因素對總評值的影響，繪制響應曲面圖［15-16］，結果如圖5（a～c）所示。

表3 回歸系數顯著性檢驗Table3 Test of significance of regression coefficient

表4 回歸方程的方差分析Table4 Analysis of variance of regression model

圖5（a）顯示當固定包合時間時，隨著投料比和包合溫度的升高，總評值呈現先增大后減小的趨勢，從等高線圖可以看出，投料比相對包合溫度對總評值的影響更大；圖5（b）顯示當包合溫度固定時，隨著投料比和包合時間的延長，總評值呈現先增大后減小的趨勢，但從等高線圖上可以看出包合時間相對投料比對總評值的影響更大；圖5（c）顯示固定投料比時，隨著包合溫度和包合時間的延長，總評值呈現先增大后減小的趨勢，但從等高線圖上可以看出包合時間相對包合溫度對總評值的影響更大。

利用SAS軟件分析，得到TFF-β-CD包合物制備的最佳工藝為：β-CD與TFF的投料比（質量比）為5.47∶1、包合溫度43.04℃、包合時間3.779 h，在此工藝條件下包合率和得率的總評預測值分別為0.8035，考慮到實際的可操作性，將最佳工藝條件修正為投料比為5.5∶1、包合溫度43℃、包合時間3.8 h。

圖5 兩因素交互作用對總評值（OD）影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots of the effect of interaction of two factors on OD value

2.3.3 最佳工藝驗證實驗 按最佳工藝條件重復3次實驗進行驗證，結果顯示平均包合率為44.68%，平均得率為73.12%，OD均值為0.8022，預測值為0.8035，偏差率為-0.16%，證明擬合模型較好地反映工藝中各因素與評價指標之間的關系，且穩定可靠。

2.4 TFF-β-CD包合物增溶作用實驗結果

利用SPSS 22.0獨立樣本T檢驗功能對TFF和TFF-β-CD包合物的溶解度實驗結果進行t檢驗統計分析，結果如表5所示。

表5 t檢驗分析結果Table5 Result of t test analysis

從表5中可以看出TFF和TFF-β-CD包合物在水中的溶解度（以100 mL水計）分別是（22.86±0.62）mg，（106.58±0.95）mg，并且Sig.（雙側）值為0，說明TFF和TFF-β-CD包合物的溶解度之間存在顯著差異。

3 結論

本實驗采用飽和水溶液法制備TFF-β-CD包合物，以包合率和包合物得率為考察指標，利用響應面分析法了確定了包合物的最佳制備工藝，結果表明TFF-β-CD包合物的最佳制備工藝條件為：β-CD與TFF的投料比為5.5∶1（質量比），包合溫度為43℃，包合時間為3.8 h，此條件下的包含率為44.68%，得率為73.12%，OD值為0.8022。經紅外光譜驗證包合物已經形成，經驗證本實驗通過響應面優化出的千斤拔黃酮-β-環糊精包合物的最佳制備工藝穩定、可靠。TFF在水中溶解度非常小，將其制備成β-環糊精包合物后，溶解度顯著增加。

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Optimization of the inclusion process of flemingia flavonoids withβ-cyclodextrin by central composite design and response surface methodology

CHEN Shuai1，2，WANG Hui-zhu1，JIANG Kun1，ZHONG Fang-li1，*
（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China；2.College of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

The aim of the experiment was to optimize the inclusion process of Flemingia flavonoids-β-cyclodextrin （TFF-β-CD）inclusion compound and identify its solubilization effect.On the basis of the pre-experiment，the formation of the inclusion compound was confirmed by infrared spectrophotometry.Using saturated aqueous solution method and the single factor test，response surface experiment was carried out to optimize the preparation process of TFF-β-CD inclusion compound with overall desirability of inclusion rate and yield as appraisement criteria.The result of pre-experiment showed that the TFF-β-CD inclusion compound had formed while the result of response surface methodology experiment showed that the optimum preparation process of TFF-β-CD inclusion compound was as follows:the feed ratio ofβ-cyclodextrin and TFF（mass ratio）5.5∶1，inclusion temperature 43℃，inclusion time 3.8 h and under the optimum conditions，the inclusion rate and the yield of the inclusion compound was 44.68%and 73.12%respectively.The solubility test showed that the solubility of TFF increased from（22.86±0.62）mg to（106.58±0.95）mg in water because of the preparation of TFF-β-CD inclusion compound.The TFF andβ-CD could form stable inclusion complexes，the formation of which could increase the solubility of TFF in water significantly.Moreover the results of experiment provided a theoretical basis for the development of the oral preparation of TFF.

Philippine flemingia；β-cyclodextrin；inclusion technology；central composite design；response surface methodology

TS202.1

B

1002-0306（2016）02-0281-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.048

2015－08－03

陳帥（1982-），男，碩士，講師，研究方向：中藥新劑型與新技術，E-mail：chenshuai2011@163.com。

*通訊作者：鐘方麗（1970-），女，博士，教授，研究方向：天然產物化學開發及應用，E-mail：fanglizhong@sina.com。

吉林省教育廳科研基金資助項目（吉教科合字［2013］第470號）；吉林化工學院科技項目（吉化院合字［2012］第051號）。