熱處理輔助水酶法提取紫蘇籽油的工藝優化

程 雪，張秀玲，孫瑞瑞，劉茜茜，劉 旭，李賽男（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

熱處理輔助水酶法提取紫蘇籽油的工藝優化

程 雪，張秀玲*，孫瑞瑞，劉茜茜，劉 旭，李賽男
（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

以紫蘇籽為原料，采用熱處理輔助水酶法為提油工藝。以單因素實驗為基礎，選擇酶解溫度，酶解時間，酶添加量以及酶解pH為自變量，紫蘇油的清油得率為響應值，采用響應面分析法進行實驗，研究各自變量及其交互作用對清油得率的影響。結果表明影響清油得率的強弱順序如下：酶添加量＞酶解溫度＞酶解時間＞酶解pH。確定最佳酶解條件為酶解溫度46℃、酶解時間3.0 h、酶添加量3.49%（纖維素酶∶中性蛋白酶=1∶2）、酶解pH6.0，驗證實驗得清油得率為59.02%，與預測值相比，相對誤差約為1.49%，說明實驗優化得到的技術參數是可靠的。

紫蘇籽油，熱處理，水酶法，響應面

紫蘇（Perilla frutescen（L.）Brit.），又稱蘇子、赤蘇等，為我國衛生部首批許可的既是食品又是藥品的60種植物之一［1］。紫蘇籽的含油量很高，能達到40%～60%，油中含有多種脂肪酸：其中含有亞麻酸56.65%，油酸16.3%，亞油酸13.1%，而棕櫚酸僅占6.61%［2］。紫蘇籽油由于富含α-亞麻酸，因此具有降低總膽固醇濃度，預防心血管疾病，抑制心肌梗塞及腦梗塞的發生，預防及抑制腫瘤形成等功效［3-4］。

我國現有的從紫蘇籽中提取紫蘇油的方法大多局限于冷榨，溶劑浸提法，超臨界CO2萃取法等［5］。水酶法是一種新興的植物油脂萃取技術，具有反應條件溫和，得到的植物油純度高等優點［6-7］。水酶法提油預處理方式有：機械粉碎、超聲波、擠壓膨化、熱處理等［8］。徐冰冰等研究超聲波輔助提取紫蘇油的工藝，發現超聲波輔助未見效果［9］。賈照寶等指出，熱處理工藝這一預處理方法能有效地提高水酶法的清油提取率［10］。因此，本實驗首次嘗試選用熱處理輔助水酶法提取紫蘇籽油。利用響應面分析法優化復合酶的酶解條件，以期為紫蘇籽油的工業化生產提供參考依據，并為紫蘇籽的綜合開發提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇籽 黑龍江省樺南縣林業局提供；堿性蛋白酶（100 kU/g）、中性蛋白酶（80 kU/g）、高溫淀粉酶（20 kU/g）、果膠酶（100 kU/g）、纖維素酶（50 kU/g） 均購于寧夏和氏璧生物技術有限公司；其余試劑 均為分析純。

HH-4數顯攪拌水浴鍋 常州賽普實驗儀器廠；萬能粉碎機 紹興市科弘儀器有限公司；YP20002電子天平 上海越平科學儀器有限公司；PHS-3C型pH計

上海市彭順有限公司；低速離心機 上海安亭儀器廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫蘇籽粗成分分析 紫蘇籽的粗成分分析均采用國標法。其中，粗蛋白采用GB/T 15589.2-2008測定；粗脂肪采用GB/T 14772-2008測定；粗纖維采用GB/T 5009.10-2003測定。

1.2.2 水酶法提油工藝路線 紫蘇籽→粉碎過篩（20目）→加一定的水攪拌→熱處理→調節pH及溫度→加酶酶解→滅酶（80℃，10 min）→離心（5000×g，15 min）→得到清油Ⅰ→冷凍-解凍破乳→離心→得到清油Ⅱ→合并清油，計算清油得率［11］。

1.2.3 酶制劑的篩選 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，按照1.2.2工藝流程，根據紫蘇籽的成分特點，選擇相應的酶制劑（堿性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、高溫淀粉酶）各加入3%（加酶質量/紫蘇籽質量，v/w），反應條件為各酶的最適條件，而后計算清油得率，選擇合適的酶進行復配。

1.2.4 熱處理輔助提油實驗 本實驗參照文獻［10］采用熱處理參數為溫度60℃，加熱時間20 min。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 料液比對清油得率的影響 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，復合酶添加量3%，酶解溫度為45℃，酶解時間為3 h，酶解體系的pH為6.0，考察料液比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 g/mL時對總清油得率的影響。

1.2.5.2 酶解溫度對清油得率的影響 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，復合酶添加量3%，酶解體系的pH為6.0，酶解時間為3 h，料液比1∶5，考察酶解溫度分別為25、35、45、55、65℃時對總清油得率的影響。

1.2.5.3 酶解時間對清油得率的影響 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，復合酶添加量3%，酶解體系的pH為6.0，溫度45℃，料液比1∶5，考察酶解時間分別為2、3、4、5、6 h時對總清油得率的影響。

1.2.5.4 酶添加量對清油得率的影響 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，酶解體系的pH為6.0，酶解溫度為45℃，酶解時間為3 h，料液比1∶5，考察復合酶添加量（v/w）分別為1%、2%、3%、4%、5%時對總清油得率的影響。

1.2.5.5 酶解pH對清油得率的影響 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，復合酶添加量3%，酶解溫度為45℃，酶解時間為3 h，料液比1∶5，考察酶解pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5時對總清油得率的影響。

1.2.6 響應面實驗 在單因素的實驗基礎之上，以清油得率為響應值，選取酶解溫度、酶解時間、酶添加量、酶解pH為影響因素，采用Box-Behnken的實驗設計，進行四因素三水平的響應面分析。其因素水平表如表1所示。

表1 Box-Benhnken設計實驗因素水平及編碼Table1 Level and code of variables for Box-Benhnken design

1.2.7 數據處理 本實驗采用Origin 8.5作圖，運用Design Expert 7.0軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 紫蘇籽粗成分分析

采用國標分析法，測得紫蘇籽的粗成分為粗脂肪含量44.32%±0.83%，粗蛋白含量在21.48%±0.76%左右，粗纖維含量在8.42%±0.39%左右。

2.2 酶制劑的篩選

根據紫蘇籽的成分分析結果可知，其蛋白和纖維素的含量都相對較高，而水酶法提油的基本原理是通過酶的作用分解植物油料中富含粗纖維的細胞壁、脂蛋白、脂多糖，從而使油釋放出來［12］。因此，擬從堿性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶以及高溫淀粉酶中篩選出酶解效果最好的酶制劑。按照上述工藝流程，各種酶的酶解條件均按其最適條件反應，其中堿性蛋白酶為溫度40℃，pH9.8；中性蛋白酶為溫度45℃，pH7.0；纖維素酶為溫度50℃，pH4.8；果膠酶為溫度55℃，pH3.5；高溫淀粉酶為溫度70℃，pH6.0。結果如圖1所示。

圖1 單一酶制劑對游離油得率的影響Fig.1 The effects of signal enzyme on the yield of free oil

根據圖1可知，在無酶的條件下，游離油得率僅為11.91%。單獨使用其他酶，得率有所提高，但是總體水平不高。這是因為酶在酶解時具有專一性，單獨使用效果有限，故考慮將酶復配使用，以提高提油率［11］。根據各種酶的最適反應條件（反應體系的pH以及溫度）、相應酶的清油提取率，選擇兩種反應條件接近、清油得率較高的酶進行復配，本文選擇纖維素酶與中性蛋白酶復配。然后，在固定反應條件的情況下，對復合酶的復配比例進行選擇，根據紫蘇籽成分特點，選取纖維素酶與中性蛋白酶的比例為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1進行實驗，結果如圖2所示，復合酶制劑明顯的提高了清油得率，這是因為細胞壁的組成成分主要是纖維素和多糖類物質［6］。而且，當纖維素酶∶中性蛋白酶=1∶2時，清油得率最高，為47.58%，這與紫蘇籽的成分含量有關。故以下均采用纖維素酶∶中性蛋白酶=1∶2的復合酶進行優化實驗。

圖2 復合酶制劑復配比例的實驗Fig.2 The test on the ratio of the complex enzymes

2.3 熱處理輔助提油實驗結果

本文選擇無預處理的水酶法提油工藝為對照組，提油工藝按1.2.2進行，結果為：對照組清油得率為32.92%，實驗組清油得率為49.44%。可以明顯的看出，熱處理這一預處理方式效果顯著。這是因為溫度升高，體系內分子的布朗運動也相應劇烈，因此脂肪球膜的破裂速度加快，同時，在溫度較高時，乳狀液的粘度也會降低，由此促進了油脂的分離，小脂肪球能夠融合，進而形成較大的油滴游離出來［13］。此外，熱處理還起到滅酶的作用，使物料中天然存在的酶（如過氧化酶、脂肪酶等）失活［14］。

2.4 水酶法提取紫蘇油單因素實驗結果

2.4.1 料液比對清油得率的影響 從圖3中可以看出，在料液比（g/mL）由1∶3～1∶5時，清油得率不斷增加，表明在水酶法提取油脂的過程中，適量增加水的比例有助于清油得率的提高，但隨著料液比繼續增加，清油得率反而降低，這說明，水分含量過高會導致酶的濃度降低，酶與底物接觸減少，不利于反應的進行。因此，料液比最佳為1∶5，其清油得率為58.35%。

圖3 料液比對紫蘇籽清油得率的影響Fig.3 The effects of sample-to-solvent ratio on the yield of free oil

2.4.2 酶解溫度對清油得率的影響 根據圖4可知，溫度在25～45℃時，清油得率呈上升的趨勢，后隨著溫度的增加，清油得率逐漸下降。這是因為對于一個酶促反應來說，溫度影響酶的活性，只有在最適的溫度條件下，酶活才能達到最大，過高或過低都會導致酶失活，進而影響清油得率。因此，本實驗采用的復合酶最適溫度為45℃，清油得率為58.21%。

圖4 酶解溫度對紫蘇籽清油得率的影響Fig.4 The effects of enzymolysis temperature on the yield of free oil

2.4.3 酶解時間對清油得率的影響 根據圖5所示，酶解時間延長，清油得率不斷增加，在酶解時間為3 h時達到最大，為58.42%，但是，酶解時間繼續增加，清油得率反而略有下降，這是因為底物減少及抑制作用增強等原因，油的釋放就不再進一步增加，同時時間過長，乳狀液的乳化程度會加大，不利于油脂的提取［15］。

圖5 酶解時間對紫蘇籽清油得率的影響Fig.5 The effects of enzymolysis time on the yield of free oil

2.4.4 酶添加量對清油得率的影響 根據圖6所示，復合酶添加量（v/w）在1%～3%時清油得率不斷上升，繼續增加酶的用量，清油得率不再增加。這是因為復合酶的酶解能力與底物量已經達到平衡，復合酶繼續增加也不會提高其酶解底物的能力，所以綜合以上情況及考慮實際成本，選擇復合酶用量為3%，此時，清油得率為56.37%。

2.4.5 酶解pH對清油得率的影響 根據圖7所示，隨著pH的增加，清油得率不斷上升，在pH為6.0時清油得率達到最大，為57.25%；pH繼續增加而清油得率下降。這是因為pH的大小會影響酶的活性，可知復合酶的活性在pH6.0時活性最高。水酶法提取油脂的過程是將蛋白質、纖維素溶解的過程，pH會影響蛋白質的溶解度，蛋白質適當溶解有利于油脂釋放，但蛋白質溶解度過大會增加乳化程度，使得提油率下降［16］。同時，pH的大小也會對酶的活力產生影響，過高或過低都會導致酶失活，進而影響提油率。

圖6 酶添加量對紫蘇籽清油得率的影響Fig.6 The effects of enzyme loading on the yield of free oil

圖7 酶解pH對紫蘇籽清油得率的影響Fig.7 The effects of pH on the yield of free oil

2.5 響應面法分析數學模型的建立

2.5.1 響應面實驗結果 在單因素的實驗基礎上，采用Box-Behnken中心組合實驗設計原理，以清油得率為響應值，選取酶解溫度（X1）、酶解時間（X2）、酶添加量（X3）、酶解pH（X4）為影響因素，進行四因素三水平的響應面分析。使用Design Expert 7.0軟件，對表2的數據進行處理、分析，得到表3回歸方程方差分析表，利用軟件進行非線性回歸的二次多項式擬合，得到預測模型如下：

對該模型進行顯著性檢驗，如表3所示，可以看出該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著，且R2=0.9268，R=0.8536，說明該模型與實際擬合度較好，自變參數與響應值之間關系顯著，因此可以用于水酶法提取紫蘇油的工藝預測。根據F檢驗可以得到各個因素影響的大小順序為：X3＞X1＞X2＞X4，即酶添加量＞酶解溫度＞酶解時間＞酶解pH。

根據回歸方程，做出響應面分析圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析各因素之間的相互作用。

2.5.2 各因素的交互作用 根據表3的方差分析表，可以看出X3、X的偏回歸系數差異極度顯著，說明酶添加量對清油得率有極顯著的影響。X1的偏回歸系數差異高度顯著，X2、X4、X1X2、X2X3、X2X4的偏回歸系數差異顯著，說明因素之間存在交互作用，因此因素對響應值不是簡單的線性關系。得到的二次回歸方程的響應曲面交互作用顯著的響應面3D分析圖。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table2 Box-Benhnken design and results

圖8 酶解溫度和酶解時間對清油得率交互影響的曲面圖Fig.8 The 3-D surface plot of enzymolysis temperature and time interaction on yield of free oil

根據圖8可知，當復合酶添加量為3.0%，酶解pH 為6.0時，隨著酶解溫度的增加，酶解時間的延長，清油得率增加。圖8中的等高線圖表現為橢圓形，故酶解溫度與酶解時間的交互作用極為顯著。

表3 方差分析Table3 Variance analysis of experimental result

圖9 酶解時間和酶添加量對清油得率交互影響的曲面圖Fig.9 The 3-D surface plot of enzymolysis temperature and enzyme loading interaction on yield of free oil

根據圖9可知，當酶解溫度為45℃，酶解pH為6.0時，隨著酶解時間的延長，復合酶添加量的增加，清油得率增加。圖9中的等高線圖表現為橢圓形，故酶解時間和酶添加量的交互作用極為顯著。

根據圖10可知，當酶解溫度為45℃，復合酶添加量為3.0%時，隨著酶解時間的延長，酶解pH的增加，清油得率增加。圖10中的等高線圖表現為橢圓形，故酶解時間和酶解pH的交互作用極為顯著。

2.5.3 最佳提取條件的確定 利用Design Expert 7.0軟件，對擬合的回歸方程進行計算，得出水酶法提取紫蘇油的最佳提取條件為：酶解溫度（X1）45.93℃、酶解時間（X2）2.95 h、酶添加量（X3）3.49%、酶解pH （X4）6.03，此時清油得率為59.91%。考慮實際操作，選擇酶解溫度（X1）46℃、酶解時間（X2）3.0 h、酶添加量（X3）3.49%、酶解pH（X4）6.0，驗證實驗得清油得率為59.02%，與預測值相比，其相對誤差為1.49%，說明實驗優化得到的技術參數是可靠的。

圖10 酶解時間和酶解pH對清油得率交互影響的曲面圖Fig.1 0 The 3-D surface plot of enzymolysis time and pH interaction on yield of free oil

3 結論

采用熱處理的方法輔助水酶法提取紫蘇籽油，清油得率由32.92%提高到49.44%，效果明顯。說明用熱處理輔助提取紫蘇籽油是可行的。通過單因素實驗以及響應面分析法對水酶法提油工藝進行優化。擬合了酶解溫度、酶解時間、酶添加量以及酶解pH這4個因素對紫蘇清油得率的回歸模型，得出影響清油得率的強弱順序如下：酶添加量＞酶解溫度＞酶解時間＞酶解pH。確定最佳酶解條件為酶解溫度46℃、酶解時間3.0 h、酶添加量3.49%、酶解pH6.0，驗證實驗得清油得率為59.02%，與預測值相比，其相對誤差為1.49%，說明實驗優化得到的技術參數是可靠的，能較為準確的預測水酶法提取紫蘇油。水酶法提取紫蘇籽油對比于其他方法，其優勢在于反應的條件溫和，油脂得率較高、品質好，且提油后的餅粕中蛋白質變性小，有利于副產物的綜合利用。該工藝所需的生產設備簡易，有利于工廠在機械壓榨的基礎上推廣使用。

［1］李鵬，朱建飛，唐春紅.紫蘇的研究動態［J］.重慶工商大學學報：自然科學版，2010，27（3）：271-275.

［2］蔡紅梅，宋寧.紫蘇籽油理化特性及脂肪酸組成的研究［J］.青海科技，2002，9（4）：48-49.

［3］于長青，趙煜，朱剛，等.紫蘇油的營養和藥用價值研究［J］.中國食物與營養，2007（8）：47-49.

［4］Kashima M，Cha G S，Isoda Y，et al.The antioxidant effects of phospholipids on perilla oil［J］.Journal of the American Oil Chemists Society，1991，68（2）：119-122.

［5］莊云，馬堯.紫蘇子油提取方法比較研究［J］.安徽農業科學，2008，36（33）：14574-14574.

［6］杜彥山，張連富.水酶法提油工藝初步研究［J］.糧食與油脂，2005（6）：10-12.

［7］De Moura J M L N，Campbell K，Mahfuz A，et al.Enzymeassisted aqueous extraction of oil and protein from soybeans and cream de-emulsification［J］.Journal of the American Oil Chemists'Society，2008，85（10）：985-995.

［8］李楊，張雅娜，齊寶坤，等.水酶法提油工藝的預處理方法研究進展［J］.中國食物與營養，2013，19（12）：24-28.

［9］徐冰冰，王瑛瑤，欒霞，等.水酶法提取紫蘇籽油脂和蛋白質的工藝條件［J］.食品科學，2012，33（22）：127-132.

［10］賈照寶，王瑛瑤，劉建學，等.水酶法提取菜籽油預處理工藝及酶復配研究［J］.食品工業科技，2008，29（10）：153-155.

［11］Tabtabaei S，Diosady L L.Aqueous and enzymatic extraction processes for the production of food-grade proteins and industrial oilfrom dehulled yellow mustard flour［J］.Food Research International，2013，52（2）：547-556.

［12］劉倩茹，趙光遠，王瑛瑤，等.水酶法提取油茶籽油的工藝研究［J］.中國糧油學報，2011，26（8）：36-40.

［13］Campbell K A，Glatz C E.Mechanisms of aqueous extraction of soybean oil［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2009，57（22）：10904-10912.

［14］齊權.水酶法提取南瓜籽油的研究［J］.安徽農業科學，2012，40（12）：7410-7413.

［15］徐效圣，潘儼，傅力，等.響應面法優化水酶法提取核桃油的工藝條件［J］.食品與機械，2010，26（2）：92-96.

［16］王文俠，任健.植物油水酶法浸提工藝研究進展［J］.現代食品科技，2005，21（2）：182-185.

Optimizing techniques of Perilla seed oil by aqueous enzymatic extraction assisted with heat treatment

CHENG Xue，ZHANG Xiu-ling*，SUN Rui-rui，LIU Qian-qian，LIU Xu，LI Sai-nan
（School of Food College，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China）

Perilla seed was used as raw material，aqueous enzymatic extraction assisted with heat treatment as the technique.On the basis of one factor test，enzymolysis temperature，time，enzyme loading and pH were chosen as independent variable，the yield of free oil as response value.Then the response surface methodology was applied to test，the effects of every independent variable as well as their interaction on the yield of free oil were researched.The results showed the orders which influenced the free oil yield were as follows:enzyme loading＞enzymolysis temperature＞enzymolysis time＞pH.And the optimized enzymolysis conditions were enzymolysis temperature 46℃，enzymolysis time 3.0 h，enzyme loading 3.49%（cellulase∶neutral protease=1∶2），pH6.0.The proof test gained the free oil yield was 59.02%，and compared with predicted value，the relative error was 1.49%.It suggested that the technical parameters optimized by test were reliable.

Perilla seed oil；heat treatment；aqueous enzymatic extraction；response surface methodology

TS224.4

A

1002-0306（2016）02-0223-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.037

2015－06－10

程雪（1990-），女，碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏工程，E-mail：15046685797@163.com。

*通訊作者：張秀玲（1968-），女，教授，研究方向：農產品貯藏加工，E-mail：zhangxiuling1118@sina.com。

黑龍江省森工總局項目（sgzjy2013018）。