產果膠酶菌株的篩選鑒定及產酶條件優化

盧曉華，楊 苗，王常高，林建國，杜 馨，蔡 俊（湖北工業大學，發酵工程教育部重點實驗室和工業發酵湖北省協同創新中心，湖北武漢430068）

產果膠酶菌株的篩選鑒定及產酶條件優化

盧曉華，楊 苗，王常高，林建國，杜 馨，蔡 俊*
（湖北工業大學，發酵工程教育部重點實驗室和工業發酵湖北省協同創新中心，湖北武漢430068）

為了得到產果膠酶菌株，采用含有以果膠為唯一碳源的溴酚藍平板，結合DP/DC值、平板顏色變化和搖瓶發酵后果膠酶活力的測定等方法進行篩選；對篩選到的菌株XHV25進行菌落形態特征、顯微形態結構觀察和18S rRNA、ITS、26S rRNA基因序列的測定與分析；通過單因素實驗優化菌株XHV25產果膠酶的發酵條件。菌株XHV25的果膠酶活力可達到2937.34 U/mL；經鑒定該菌株XHV25為囊酵母（Zygoascus sp.）；其最適發酵產酶條件為：培養基初始pH為5.5，搖床轉速為160 r/min，接種量為4%（v/v），裝液量為25 mL/250 mL，發酵溫度為31℃，發酵時間為48 h；在此發酵條件下果膠酶活力為4849.90 U/mL，較優化前顯著提高了65.11%。

果膠酶，篩選，鑒定，囊酵母（Zygoascus sp.），產酶條件優化

果膠是植物中由一系列包含部分甲基酯化的半乳糖醛酸亞單位通過α-1，4-糖苷鍵連接的復雜結構多糖［1］。果膠酶是能分解果膠物質的復合酶類的總稱。按果膠酶對果膠底物作用的方式可分為四類：聚半乳糖醛酸酶、原果膠酶、裂解酶和果膠酯酶［2］。多年來，果膠酶已應用于幾種傳統的工業生產過程，例如果汁果酒的生產提取，紡織加工和棉纖維的生物煮練，植物韌皮纖維麻類脫膠，廢水處理，咖啡和茶發酵，動物飼料，植物病毒的純化，石油開采，飲料和葡萄酒［3-6］。

果膠酶可從植物或諸如真菌和細菌等的微生物中分離得到［7-8］，但天然來源于植物的果膠酶產量低且不易提取，難以大規模制備。目前微生物已成為生產果膠酶的優良生物資源，主要包括黑曲霉（Aspergillus niger）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、米根霉（Rhizopus oryzae）等［9-11］，其中黑曲霉也已成為工業生產果膠酶最為安全常見的真菌菌種［12］，但果膠酶的產量和質量依然不能滿足食品工業的需求。選育新的高產果膠酶優良菌種，成為果膠酶工業化生產的關鍵。

近年來，研究產果膠酶的微生物主要集中在黑曲霉和枯草芽孢桿菌等，但極少有報道利用酵母產果膠酶相關的研究。本文采用以果膠為唯一碳源的平板篩選到一株產果膠酶的酵母菌株XHV25，并通過單因素實驗優化該菌株產果膠酶的發酵條件，以期選育出高產果膠酶菌株，為果膠酶的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙子皮粉 自制過100目篩；果膠和半乳糖醛酸 Sigma公司；3，5-二硝基水楊酸 國藥集團化學試劑有限公司；溴酚藍 Amresco；富集培養基 牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖3 g，NaCl 1 g，MgSO41 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KH2PO40.5 g，水1000 mL；初篩培養基 果膠5 g，NaNO33 g，NaCl 1 g，MgSO41 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KH2PO40.5 g，溴酚藍0.1 g，瓊脂20 g，水1000 mL；發酵培養基：桔皮粉20 g，蛋白胨5 g，NaCl 1 g，MgSO41 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KH2PO40.5 g，水1000 mL；種子培養基 葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，水1000 mL；YPD培養基 葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，瓊脂20 g，水1000 mL；其他試劑 均為分析純。

PHS-25 pH計 上海雷磁；3K15冷凍離心機 德國Sigma公司；SynergyTM2多功能酶標儀 BioTek。

1.2 實驗方法

1.2.1 初篩 取樣品約10 g置于適量無菌生理鹽水中，充分攪拌靜置后吸取4 mL接種于100 mL富集培養基，30℃搖床振蕩培養24 h。取富集培養后的菌懸液0.5 mL做適當梯度稀釋，再取不同稀釋度的菌懸液0.1 mL涂布于初篩培養基上，30℃培養48 h后，挑選出能使溴酚藍平板生成黃色圈的單菌落，進行菌株的劃線分離純化［13］；將純化好的菌株劃線接種于初篩平板上培養60 h后，測量其變色圈直徑（Dp）和菌落直徑（Dc），挑選出Dp/Dc值較大的菌株作復篩的出發菌株［14］。

1.2.2 復篩 取上述初篩所得到的Dp/Dc值較大的菌株接種于液態初篩培養基中，30℃振蕩培養24 h后，再取3 mL培養液接種于50 mL/250 mL發酵培養基中，30℃振蕩培養48 h。發酵液9000 r/min離心15 min后，吸取上清液適當稀釋作稀釋粗酶液，采用DNS法使用酶標儀測定稀釋粗酶液的果膠酶活力，篩選出酶活力較高的菌株。

1.2.3 菌株鑒定和保藏 菌株鑒定和保藏由中國典型培養物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）執行。鑒定內容包括：微生物菌株的形態特征，18S rRNA基因序列、ITS序列和26S rRNA基因序列的測定與分析，微生物菌株碳源氧化和利用檢測。菌株XHV25已于2015年3月31日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2015183。

1.2.4 粗酶液的制備 取上述篩選出的菌株接種于種子培養基，置于30℃、160 r/min搖床振蕩培養14 h，此時種子培養液的菌體細胞達108個/mL。取3 mL（接種量6%）種子培養液接種于50 mL發酵培養基，30℃搖床振蕩培養48 h。4℃、8000 r/min離心15 min后取上清液即得粗酶液。

1.2.5 酶活測定

1.2.5.1 半乳糖醛酸標準曲線的繪制 取標準D-半乳糖醛酸溶液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，分別置于11支25 mL具塞比色管中，分別用蒸餾水補足至2 mL，各加入DNS試劑［14］3 mL，置沸水浴中煮沸10 min，然后以流動水迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，充分混勻，各取0.2 mL于96孔板中，用酶標儀在540 nm處測定吸光度，以吸光值（A）為橫坐標，半乳糖醛酸濃度（B，mg/mL）為縱坐標，繪制標準曲線，得標準曲線方程為B=0.23×A-0.03（R2=0.9940）。

1.2.5.2 酶液酶活的測定 吸取1.8 mL質量分數為1%的果膠底物溶液（用pH為5.0的檸檬酸－磷酸鹽緩沖液配制）于具塞比色管中，加入0.2 mL稀釋粗酶液，50℃水浴精確反應30 min后取出，加入3 mL DNS試劑混勻后立即用沸水浴10 min滅活，定容至25 mL；以煮沸滅活的粗酶稀釋液作為空白對照［15-16］。用酶標儀在波長540 nm處測OD值。果膠酶活力的定義：在上述反應條件（50℃，pH5.0）下，1 mL酶液每分鐘水解果膠底物生成1 μg半乳糖醛酸的能力定義為1個酶活力單位D（U）。

D=（B×C×1000）/（0.2×30）

式中，C為粗酶液的稀釋倍數，D為酶活（U）。

1.2.6 發酵產酶條件實驗 初始發酵條件為：發酵溫度30℃，發酵時間48 h，初始pH為6.0，搖床轉速160 r/min，接種量6%（v/v），裝液量50 mL/250 mL。

采用單因素實驗研究了初始pH、搖床轉速、接種量、裝液量、發酵周期、發酵溫度對菌株XHV25產果膠酶活力的影響。

1.2.6.1 初始pH的單因素實 調整初始pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，其他發酵條件為初始發酵條件。研究初始pH對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力的影響，每組三個平行。

1.2.6.2 搖床轉速的單因素實驗 初始pH取上述實驗確定的最優結果，調整搖床轉速分別為140、160、180、200、220 r/min，其他發酵條件為初始發酵條件。研究搖床轉速對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力的影響，每組三個平行。

1.2.6.3 接種量的單因素實驗 初始pH和搖床轉速取上述實驗確定的最優結果，調整接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%（v/v），其他發酵條件為初始發酵條件。研究接種量對對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力的影響，每組三個平行。

1.2.6.4 裝液量的單因素實驗 初始pH、搖床轉速和接種量取上述實驗確定的最優結果，采用250 mL搖瓶裝液，調整搖瓶裝液量分別為12.5、25、37.5、50、62.5、75 mL，其他發酵條件為初始發酵條件。研究裝液量對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力的影響，每組三個平行，并通過SPSS作不同裝液量對酶活的差異顯著性分析。

1.2.6.5 發酵溫度的單因素實驗 初始pH、搖床轉速、接種量和裝液量取上述實驗確定的最優結果，調整發酵溫度分別為25、28、31、34、37、40℃，其他發酵條件為初始發酵條件。研究發酵溫度對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力的影響，每組三個平行。

1.2.6.6 發酵時間的單因素實驗 初始pH、搖床轉速、接種量、裝液量和發酵溫度取上述實驗確定的最優結果，調整發酵時間分別為12、24、36、48、60、72、84 h。研究發酵溫度對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力的影響，每組三個平行。

1.3 數據處理

用軟件Origin 8繪制出發酵產酶條件優化的各個單因素圖。用SPSS進行差異顯著性分析，p＜0.05差異顯著。

2 結果與討論

2.1 菌株的篩選

2.1.1 初篩 初篩是根據菌株生長時利用果膠使平板產生變色圈（水解圈）的能力，挑選出Dp/Dc值較大的菌株作為復篩的出發菌株。最終篩選得到的菌株中有24株降解果膠能力較好的菌株，其水解圈和菌落直徑結果見表1。通過平板菌落觀察，發現菌株38、40的菌落由中間致密的一點向外蔓延著不規則的絲絨狀菌絲，可初步確定為放線菌；菌株b1、q3的菌落形態較大，菌絲質地疏松，不透明，呈白色絨毛棉絮狀，可初步確定為霉菌；菌株hq1、hq2的菌落形態較大，菌絲呈疏松的黑色蛛網狀交織，與培養基連接緊密，不易挑起，可初步確定為霉菌；其他菌株在以果膠為唯一碳源的初篩平板上呈白色，邊緣齒狀不規則，繼續培養一段時間后菌體從中心向外由白色變黑色。部分菌株如b1、v25的變色圈（水解圈）見圖1、圖2。菌株v25的菌落呈白色凸起狀，較濕潤，質地均勻，邊緣略呈齒狀不規則，繼續培養一段時間后菌體從中心向外由白色變黑色；圍繞菌落周圍由紫色變成直徑大小不一的黃色圈，其變黃的程度也有所差異。

2.1.2 復篩 將初篩得到的24株菌株在斜面活化后制備種子液，接種于液態發酵培養基發酵后測定粗酶液的果膠酶活力，其果膠酶活力見表2。其中菌株v25的果膠酶活力最大，為2937.34 U/mL，將菌株v25重新命名為XHV25。

圖1 菌株b1的水解圈Fig.1 Hydrolysis circle of strain b1

圖2 菌株v25的變色圈Fig.2 Discoloration circle of strain v25

2.1.3 菌株的鑒定 菌株XHV25在YPD平板上的菌落呈圓形，乳白色，表面光滑濕潤，豐厚粘稠，邊緣較整齊，其顯微鏡和平板菌落觀察分別見圖3、圖4。對菌株XHV25的18S rRNA、ITS、26S rRNA基因序列進行測定后再在NCBI中使用Blast進行比對，發現XHV25的ITS序列與Zygoascus meyerae（HM450996.1，GenBank）、Z.hellenicus（AY447034.1，GenBank）具有99%的相似度；XHV25和Z.meyerae、Z.hellenicus的18S rRNA、26S rRNA基因序列同源性最高，根據以上結果分析確定菌株XHV25為囊酵母（Zygoascus sp.）。

2.2 發酵產酶條件優化

表1 水解圈直徑（Dp）與菌落直徑（Dc）比值Table1 Hydrolysis circle diameter（Dp）and colony diameter（Dc）ratio

2.2.1 培養基初始pH對果膠酶活力的影響 由圖5可知，隨著pH的增大菌株XHV25所產果膠酶的酶活逐漸增加，在pH為5.5時酶活達到最大值為3096.38 U/mL。隨pH數值的進一步增大，果膠酶的酶活反而逐漸減少，說明此菌在弱酸性的條件下，比較適合產酶，pH過高或過低對產酶都會產生很大的抑制作用。據方差分析，培養基初始pH對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

表2 24株菌株所產的果膠酶活力Table2 Pectinase activity of 24 strains produced

圖3 菌株XHV25顯微鏡（400×）Fig.3 Strain XHV25 microscope observed（400×）

圖4 菌株XHV25平板菌落觀察Fig.4 Strains XHV25 colony observed

2.2.2 搖床轉速對果膠酶活力的影響 由圖6可知，當搖床轉速為160 r/min時，菌株XHV25所產果膠酶的酶活達到最大值為3427.27 U/mL。隨轉速的繼續增大，酶活趨于稍微降低。據方差分析，搖床轉速對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

圖5 培養基初始pH對果膠酶活力的影響Fig.5 Effect of initial pH on pectinase activity

圖6 搖床轉速對果膠酶活力的影響Fig.6 Effect of rotating speed on pectinase activity

2.2.3 接種量對果膠酶活力的影響 由圖7可知，當接種量為4%（v/v）時，菌株XHV25所產果膠酶的酶活達到最大值為3570.94 U/mL。此后，隨著接種量的增大酶活逐漸下降，可能是因為接種量的增大導致發酵液中菌體濃度過高，導致菌體生長旺盛，營養物質消耗過快，溶氧不足，代謝受抑制，致使產酶能力降低。據方差分析，接種量對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

圖7 接種量對果膠酶活力的影響Fig.7 Effect of inoculum concentration on pectinase activity

2.2.4 裝液量對果膠酶活力的影響 由圖8可知，當裝液量為25 mL/250 mL時，菌株XHV25所產果膠酶的酶活達到最大值為4562.30 U/mL，此時發酵培養基中的溶氧最適合菌體生長和代謝產酶。在最適裝液量25 mL/250 mL以后，隨著裝液量的增大，酶活明顯逐漸降低，可能是因為發酵體系溶氧不足，或菌體生長與代謝產酶失去平衡，從而代謝產酶過程受抑制。據方差分析，裝液量對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

圖8 裝液量對果膠酶活力的影響Fig.8 Effect of loading volume on pectinase activity

2.2.5 發酵溫度對果膠酶活力的影響 由圖9可知，當溫度為31℃時，菌株XHV25所產果膠酶的酶活達到最大值為4654.32 U/mL，但當溫度進一步增大時，酶活極速下降，可能是因為溫度過高，不利于代謝產酶。據方差分析，發酵溫度對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

圖9 發酵溫度對果膠酶活力的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on pectinase activity

2.2.6 發酵時間對果膠酶活力的影響 由圖10可知，在發酵時間為48 h時，菌株XHV25所產果膠酶的酶活達到最大值為4849.90 U/mL。發酵初期，培養基中的營養物質主要用于菌體的生長，代謝產物積累較少。此后，隨著發酵時間的繼續延長，酶活略微降低，可能是因為營養物質的耗盡及代謝產物的大量積累，導致菌體自溶。據方差分析，發酵時間對囊酵母（Zygoascus sp.）產果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

圖10 發酵時間對果膠酶活力的影響Fig.1 0 Effect of fermentation time on pectinase activity

3 結論

本研究采用含有以果膠為唯一碳源的溴酚藍平板分離得到產果膠酶的菌株，通過測定各菌株所產果膠酶活力復篩選出產果膠酶菌株XHV25，其酶活可達到2937.34 U/mL。通過對菌株XHV25進行菌落形態特征、顯微形態結構觀察和18S rRNA、ITS、26S rRNA基因序列的測定與分析，確定該菌株XHV25為囊酵母屬（Zygoascus sp.）。該菌株已于2015年3月31日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2015183。通過單因素實驗確定該菌株的最適發酵產酶條件為：培養基初始pH為5.5，搖床轉速為160 r/min，接種量為4%，裝液量為25 mL/250 mL，發酵溫度為31℃，發酵時間為48 h，在此發酵條件下果膠酶活力可達4849.90 U/mL，較優化前顯著提高了65.11%。

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Screening and identification of pectinase-producting strains and optimization of pectinase-producting condition

LU Xiao-hua，YANG Miao，WANG Chang-gao，LIN Jian-guo，DU Xin，CAI Jun*
（Key Laboratory of Fermentation Engineering（Ministry of Education），Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

To obtain the pectinase-producing strains，the bromophenol blue plate separation method which contains the pectin as the sole carbon source was used，combined with DP/DCvalue and flat color changes.The strains screened were inoculated for the liquid fermentation culture，and the activities were determinated，then screened again out a strain XHV25 with the pectinase activity of 2937.34 U/mL.Morphology，physiology and biochemistry research coupled with 18S rRNA，ITS，26S rRNA sequence and analysis indicates that the strain of XHV25 was Zygoascus sp.Single-factor method was used for optimizing the fermentation condition.The optimum pectinase-producting conditions were as follows:initial medium pH5.5，shaking speed 160 r/min，inoculum amount 4%（v/v），loading volume 25 mL/250 mL，optimum fermentation temperature 31℃，fermentation time 48 h.Under this fermentation conditions，pectinase activity reached 4849.90 U/mL，which was 65.11%higher than that of before optimization.

pectinase；screening；identification；Zygoascus sp.；optimization of fermentation conditions

TS201.3

A

1002-0306（2016）02-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.030

2015－05－11

盧曉華（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向：發酵過程優化與放大，E-mail：924268082@qq.com。

*通訊作者：蔡俊（1968-），男，博士，教授，研究方向：微生物發酵工程，E-mail：caijun@mail.hbut.edu.cn。

湖北省自然科學基金重點項目（2009CDA059）。