高產信號分子AI-2乳酸菌的篩選及鑒定

李 博，顧 悅，燕彩玲，賈原博，賀銀鳳（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

高產信號分子AI-2乳酸菌的篩選及鑒定

李 博，顧 悅，燕彩玲，賈原博，賀銀鳳*
（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

通過V.harveyi BB170生物學方法檢測分離自內蒙古錫盟地區的8株乳酸菌產生群體感應信號分子AI-2的情況，篩選出高產信號分子AI-2的菌株進行分子生物學鑒定，并探究信號分子AI-2變化規律。結果表明：8株乳酸菌均能夠分泌具有活性的信號分子AI-2，其中，菌株2-1產信號分子AI-2的能力顯著優于其他7株乳酸菌（p＜0.05）；高產AI-2的乳酸菌菌株2-1經鑒定為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）；隨著2-1菌體的生長信號分子AI-2的濃度也隨之增大，并且信號分子AI-2濃度在穩定期初期達到最大值。

群體感應，乳酸菌，信號分子AI-2

群體感應（QS）系統，指細菌在生長過程中一般可以自發地釋放一些特定的自誘導信號分子（AIs），當這些信號分子被自身或環境中的其他個體感知到時，會通過改變自身某些基因的表達而作出反應，從而調節特定的生理功能，協調群體行為。QS系統由自誘導分子、感應蛋白及其下游調控蛋白組成。根據細菌合成感應機制和信號分子種類的不同，QS系統主要分為三類：革蘭氏陰性菌（G-）的AHL-LuxI/LuxR系統，由寡肽介導的革蘭氏陽性菌（G+）雙組分感應系統，LuxS/AI-2介導的QS系統［1］。

LuxS/AI-2介導的QS系統是Bassler等［2］在哈氏弧菌（Vibrio harveyi，V.harveyi）的生物發光現象中首次發現的，它可以分泌兩種自體誘導分子AI-1和AI-2，并且均可控制相關基因的表達［3］。實驗中用到的指示菌株V.harveyi BB170是標準菌株V.harveyi BB120的定向突變菌株，其信號分子AI-1的感受器是缺失的，故只能對信號分子AI-2發生反應并發光。V.harveyi BB170產生信號分子AI-2的luxS基因是完整的，在菌體密度達到一定程度時，可自行產生信號分子AI-2。V.harveyi BB170是目前國際上通用的、便捷高效的檢測信號分子AI-2的指示菌株［4］。

目前發現，LuxS/AI-2介導的QS系統存在于多種革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌中，不同菌種間其表達的蛋白質同源性也較高，其分泌的信號分子AI-2的結構也相似，信號分子AI-2可以引起種間信息的交流［5］，所以LuxS/AI-2介導的QS系統可能主要用于不同菌種間交流。研究表明，LuxS/AI-2介導的QS系統對乳酸菌的酸耐受能力、抑制病原微生物、對腸表皮細胞的黏附性、生物膜的形成以及在動物消化道中的存活性等具有介導作用［6-11］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8 株實驗菌株 均分離自內蒙古錫盟地區酸馬奶酒中，由內蒙古傳統乳制品中乳酸菌與酵母菌互生機理課題組提供；V.harveyi BB170 購自ATCC；MRS液體培養基 按照文獻［12］方法配制；AB培養基 按照文獻［13］方法配制；細菌基因組提取試劑盒 北京天根公司。

HZQ-C氣浴恒溫振蕩器 精達公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州智凈公司；高壓滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司；SK-1快速混勻器 武漢格萊莫公司；LG10-24A離心機 湘潭離心機有限公司；核酸電泳儀 美國伯樂公司；GelDoc XR+凝膠成像儀 美國伯樂公司；快速梯度PCR儀 美國ABI公司；Thermo Scientific Multiskan FC酶標儀 美國Thermo公司；VICTOR X3 Multilabel Plate Reader 美國Perkin Elmer儀器有限公司；恒溫培養箱 上海精密儀器有限公司。

1.2 菌種保藏和活化

將8株乳酸菌分別接種于滅菌后的MRS液體培養基中，于37℃活化培養三代，在第三代生長到對數期的發酵液中加入20%甘油，分別裝入2 mL離心管置于-80℃冰箱進行保藏。每次使用按2%的接種量接種于新鮮MRS培養基中，每代于37℃培養24 h，連續培養三代即可用于實驗。

V.harveyi BB170使用AB培養基活化三代，在第三代生長到對數期的發酵液中加入20%甘油，分裝入2 mL離心管置于-80℃冰箱進行保藏。每次使用按2%的接種量接種于新鮮AB培養基中，每代于30℃振蕩培養13 h，連續培養三代即可用于實驗。

1.3 高產信號分子AI-2乳酸菌的篩選

1.3.1 乳酸菌上清液的制備 將8株乳酸菌按2%接種至滅菌后的液體MRS培養基中，37℃繼續培養19 h后，將菌液移入滅菌的10 mL離心管中6000 r/min離心10 min，棄去菌泥，上清液用0.22 μm的滅菌濾菌器過濾至2 mL離心管中，得到各乳酸菌的無菌上清液；按相同方法收集30℃振蕩培養13 h的V.harveyi BB170無菌上清液，作為陽性對照；用0.22 μm滅菌濾菌器分別過濾滅菌的AB培養基和MRS培養基，作為陰性和介質對照。無菌上清液分別貯藏于-80℃冰箱。

對比組患者二尖瓣瓣膜病變檢出率為25%，主動脈瓣膜病檢出率為50%，其他病變檢出率為25%，研究組檢出率分別為22.22%、44.44%、33.33%，試驗組檢出率分別為20%、80%，具體構成情況見表。

1.3.2 上清液中信號分子AI-2的生物學檢測 發光檢測實驗方法參考文獻［13］。將V.harveyi BB170按 2%接種于滅菌后的AB培養基，轉速90 r/min，30℃培養12 h左右至培養基混濁（OD600 nm為0.7～1.2），然后用新鮮的AB培養基以1∶5000稀釋V.harveyi BB170培養液，隨后充分振蕩混勻備用。分別將各乳酸菌、V.harveyi BB170、AB培養基和MRS培養基濾過的無菌上清液作為待測樣品、陽性、陰性和介質對照，按體積比1∶100與上述稀釋過的V.harveyi BB170培養液混合，置于30℃繼續振搖培養。在1～6 h內，每30 min取200 μL/孔至96孔黑色酶標板中，用多功能酶標儀的化學發光模式檢測其熒光強度值，以時間為橫坐標，相應時間點的熒光強度為縱坐標繪制曲線。樣品與對照均取復孔，每次實驗重復兩次。在1～6 h內，以陰性對照組熒光強度值降到最小時的時間點為基準（在3 h左右），信號分子AI-2的濃度用相對熒光強度表示，計算公式如下［14］。

陽性對照組相對熒光強度=陽性對照的熒光強度值/陰性對照的熒光強度值

待測組相對熒光強度=待測樣品的熒光強度值/介質對照的熒光強度值

1.4 高產信號分子AI-2乳酸菌的分子生物學鑒別

1.4.1 細菌總DNA的提取及PCR產物的檢測 使用細菌基因組提取試劑盒對高產信號分子AI-2乳酸菌的基因組進行提取，提取方法詳見試劑盒說明書。實驗菌株16S rRNA序列PCR擴增引物F：5＇-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′R：5′-CCGTCAATTCCTTTGAGT TT-3′，參照文獻［15］中所提供的引物。PCR擴增片段約為900 bp。PCR擴增體系為50 μL，其中模板DNA 2 μL、上下游引物各2 μL、DreamTaq Green PCR Master Mix 25 μL、加無菌水補至50 μL。PCR條件參數為：預變性94℃、3 min，變性94℃、30 s，退火57.4℃、30 s，延伸72℃、90 s，35個循環，最后末端延伸72℃、5 min。取5 μL實驗菌株PCR擴增產物與1 μL 6×Loading Buffer混勻，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，110 V、30 min，凝膠成像系統觀察條帶。PCR產物送上海生工測序。

1.4.2 同源性分析與系統發育樹的構建 利用BLAST （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將所測定菌株的16S rDNA序列，與GenBank數據庫中已知細菌的16S rDNA序列進行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。然后用DNA star軟件以Mega 5.2.2進行校準排齊，繪制系統發育樹。

1.5 信號分子AI-2與OD595 nm值的關系

將高產信號分子AI-2乳酸菌株2-1按2%接種至滅菌后的MRS液體培養基中，于37℃繼續培養4、7、10、13、16、19、22、25 h后，分別測定不同時間點OD595 nm值。不同時間點上清液的提取和信號分子AI-2的測定方法同1.3.1和1.3.2。

1.6 數據處理

數據采用SPSS軟件11.0版本，在顯著水平為0.05下進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 高產信號分子AI-2乳酸菌的篩選

由圖1可知，介質對照、陰性對照、陽性對照的熒光強度在1～2.5 h隨著孵育時間的延長而下降，在2.5 h陽性對照熒光強度降到最低，之后其熒光強度上升。而介質對照和陰性對照由于信號分子AI-2的濃度較低，熒光強度一直降到3 h，在3 h降到最低點，隨后介質對照和陰性對照的熒光強度開始呈上升趨勢，由于陰性對照只含有由AB培養基稀釋后的指示菌，表明在培養過程中由指示菌V.harveyi BB170產生的AI-2濃度達到誘導其發光的閾值的時間為3 h，故以3 h作為基準點來計算相對熒光強度。

依據文獻［16-17］和實驗室前期研究，大量乳酸菌產生信號分子AI-2的最大值均出現在對數期末期或穩定期初期，故選擇對8株乳酸菌培養19 h上清液進行熒光檢測，以孵育3 h的熒光強度作為基準點，比較其相對熒光強度，見圖2。由圖2知，八株乳酸菌的相對熒光強度差異性較大，且均顯著高于陰性對照（p＜0.05），說明8株乳酸菌均可以產生信號分子AI-2，并且菌株1-3-2、2-1、5-2-1的相對熒光強度均顯著高于其他5株菌（p＜0.05），其中菌株1-3-2和5-2-1相對熒光強度與陽性對照相當，2-1相對熒光強度顯著高于陽性對照（p＜0.05），達到陽性對照的1.5倍，故后續實驗選取菌株2-1。

圖1 不同孵育時間各樣品的熒光強度值Fig.1 The luminescence of different incubation time of samples

圖2 各乳酸菌培養19 h上清液的相對熒光強度Fig.2 The relative luminescence of lactic acid bacteria in incubation time 19 h

2.2 高產信號分子AI-2乳酸菌的分子生物學鑒定

圖3 16S rDNA基因PCR產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 16S rDNA gene amplified by PCR

乳酸菌菌株2-1的16S rDNA基因PCR產物電泳結果見圖3，由圖3可見菌株2-1 PCR的16S rDNA產物大約在900 bp的位置。菌株2-1的16S rRNA序列與GenBank中已知菌株的基因序列進行同源性比較，系統發育樹結果見圖4。

圖4 菌株2-1與其他乳酸菌的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 2-1 to other lactic acid bacteria

由系統發育樹可直觀地看出乳酸菌菌株2-1和已知菌株的親緣關系，2-1與菌株Lactobacillus fermentum strain CIP 1029和Lactobacillus fermentum strain NBRC 158在同一分支，且同源性最高，都達到99.8%，由此可判定這菌株2-1為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。

2.3 信號分子AI-2與發酵乳桿菌2-1菌體密度之間的關系

以孵育3 h為基準點，計算發酵乳桿菌2-1不同培養時間的相對熒光強度。以培養時間為橫坐標，不同培育時間菌體的OD595 nm值和相對熒光強度為縱坐標，繪制曲線，探討菌體密度與信號分子AI-2的關系，見圖5。由圖5知，在4～16 h，隨著培養時間的延長，發酵乳桿菌2-1的OD595 nm值逐漸增大，相對熒光強度也在逐漸上升，并在19 h達到最大值，且顯著高于其他時間點的相對熒光強度（p＜0.05），這表明信號分子AI-2與乳酸菌2-1菌體密度在一定范圍內呈正相關。目前文獻［13］中報道，當菌體密度過大，會造成熒光強度的降低。在本實驗中，當培養時間超過19 h后，隨著培養時間的延長，OD595 nm值不再變化，而相對熒光強度開始下降，這可能是由于菌體重新將信號分子AI-2吸收入菌體內，來調控某些重要生理功能［18］。

圖5 發酵乳桿菌2-1上清相對熒光強度與OD595 nm的關系Fig.5 The relationship between the relative luminescence and OD595 nmabs

3 結論

利用V.harveyi BB170檢測系統，檢測8株乳酸菌均可以產生信號分子AI-2，但是差異性較大，其中菌株2-1、1-3-2、5-2-1產信號分子AI-2的能力明顯高于其他5株乳酸菌，尤其以菌株2-1最為突出。乳酸菌2-1經過16S rDNA分子生物學鑒定，確定其為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。發酵乳桿菌2-1可以分泌具有活性的信號分子AI-2，隨著菌體密度的增加，信號分子AI-2的濃度逐漸增加，并在19 h達到峰值，之后隨著培養時間繼續延長，信號分子AI-2的濃度下降。

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Screening and identification of AI-2 high-producing lactic acid bacteria

LI Bo，GU Yue，YAN Cai-ling，JIA Yuan-bo，HE Yin-feng*
（College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

The V.harveyi bioassay method was carried out to explore that 8 lactic acid bacteria which isolated from koumiss of Ximeng region in Inner Mongolia produced the quorum-sensing signal autoinducer-2（AI-2）and found the production pattern.AI-2 high-producing strain was screened for molecular biological identification and relationship between AI-2 and bacterial density was further studied.The results showed that all strains could produce AI-2，among of which the ability of AI-2 production of strain 2-1 was superior（p＜0.05）and identified as a Lactobacillus fermentum.The concentration of AI-2 increased with bacterial density and the largest amount of AI-2 was observed in the early stationary phase in the culture of strain 2-1.

quorum sensing；lactic acid bacteria；signal autoinducer AI-2

TS201.3

A

1002-0306（2016）02-0185-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.029

2015－07－02

李博（1991-），男，碩士研究生，研究方向：乳品微生物，E-mail：libo910208@126.com。

*通訊作者：賀銀鳳（1960-），女，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：heyinf6468@yahoo.com.cn。

國家自然科學基金資助項目（31360396）。